越來越多的證據表明，n6 -亞甲基腺苷(m⁶A)調節劑參與了結直腸癌(CRC)的病因和進展。然而，m6A閱讀器參與糖酵解代謝的確切機制仍不清楚。本文旨在通過m6A與糖酵解代謝的交互作用，揭示CRC進展的新機制。

本文技術路線：

1、CRC細胞和組織中IMP1/2/3表達與異常調節的LncRNAs的相關性

IMP屬于一種m6A閱讀器，在CRC中IMP1/2/3家族如何識別lncRNAs尚未被探索。作者首先分析了IMP1，IMP2，IMP3在CRC組織中的表達量，結果發現在CRC組織中，只有IMP2過表達，且其表達量遠高于IMP1和IMP3（Fig 1B）。在7個CRC細胞系中(LOVO，CACO2、SW48、SW480、HT29、HCT116和SW620)，IMP2的表達量均高于正常人腸上皮細胞系(HIEC) (Fig. 1c)。m6A斑點雜交實驗顯示CRC細胞系，特別是HCT116，SW620，HT29細胞株的m6A水平顯著高于正常的結直腸上皮細胞HIEC中m6A水平(Fig. 1d)。這也符合IMP2的功能，即穩定RNA表達，增加總RNA的m6A水平。然后，通過TCGA數據庫和GEO數據庫分析發現，在CRC中，7個lncRNA候選基因中，ZFAS1、SNHG15和CRNDE均顯著表達。在CRC細胞中，ZFAS1表現出最顯著的過表達(Fig. 1e)。通過檢測正常對照細胞HIEC和CRC細胞系（HCT116、SW620、SW480、LOVO、HT29、CACO2、SW48）中ZFAS1、CRNDE和SNHG15的RNA表達水平，發現在CRC細胞中，ZFAS1表達量顯著上升(Fig. 1f)。然后，對IMP1/2/3與ZFAS1進行相關性研究，結果表明，ZFAS1與IMP2呈顯著正相關(R = 0.6476, P < 0.0001, Fig. 1g)。但ZFAS1和IMP1或IMP3之間沒有明顯的相關性。

接下來，為了研究IMP2在ZFAS1表達及其相關m6A甲基化水平中的潛在作用，作者采用組織芯片(TMA)、RNA原位雜交(ISH)和免疫組織化學(IHC)檢測了在配對的CRC組織和匹配的鄰近腫瘤對照中IMP2、m6A、和ZFAS1的表達水平(Fig. 1h)。CRC組織中IMP2, ZFAS1的表達量以及m6A表達水平明顯增高(Fig. 1i)。進一步進行相關性分析發現，IMP2和ZFAS1表達量以及m6A水平正相關(Fig. 1j)。

通過臨床分析發現，上調的IMP2表達顯著縮短了總生存期和無病生存，同樣，m6A甲基化的高表達與總生存期短顯著相關，同時， ZFAS1表達較高的患者總生存期和無病生存期顯著降低(Fig. 1k)。

這些結果表明，在人類CRC細胞和組織中，IMP2過表達，并伴有相關的m6A甲基化水平和ZFAS1表達。這些指標也顯示出未來作為CRC評估和治療生物標志物的獨立預后預測因子的潛在功能。

Fig1 CRC細胞及患者組織中IMP1/2/3與lncRANs表達的關系

2、IMP2通過直接結合結直腸癌細胞中ZFAS1的m6A位點，促進ZFAS1的穩定性

為了探究IMP2介導的m6A穩定性及其相關ZFAS1表達在CRC腫瘤發生和發展中的關鍵生物學特性，作者在HCT116和SW620 CRC細胞系中干擾IMP2表達，然后檢測IMP2和ZFAS1的表達量。結果表明，異位的IMP2表達顯著增強了ZFAS1和IMP2的表達。然而，IMP2敲低抑制了ZFAS1和IMP2的表達(Fig. 2b )。此外，在挽救實驗中，在IMP2敲低的CRC細胞中上調ZFAS1檢測到ZFAS1表達恢復(Fig. 2C )。更重要的是，RNA穩定性分析發現IMP2敲低或放線菌素D在不同時間點(0,2,4,6 h) 進行處理都會縮短ZFAS1 RNA的半衰期(Fig. 2D )。這些結果初步確信，作為m6A閱讀器的IMP2對ZFAS1具有穩定作用。為了驗證IMP2和ZFAS1之間的直接關系，通過RIP-seq發現，在HEK293T細胞中，異位IMP2表達顯著富集了內源性ZFAS1(Fig. 2e)。此外，CLIP數據庫顯示IMP2蛋白具有特定的結合域識別ZFAS1序列中的m6A的RGGAC/ rach基序(Fig. 2F)。

同樣，通過Cuilab進行生信分析在ZFAS1基因中成功地發現了4個m6A結合基序RGGAC和1個m6A結合基序RAGAC(Fig. 2g)。catRAPID和MOE平臺也被用來確定在二級和三級結構水平上的直接結合域(Fig. 2h, i)。ZFAS1的“RGGAC”基序(+833 ~ +869)與IMP2 蛋白序列的KH3-4結構域(+198 ~ +249)具有顯著的交互傾向性(值= 206)和識別能力(100%)，其交互強度為98% (Fig. 2h)。

MOE軟件分析了識別 ZFAS1的RGGAC/RRACH基序與IMP2 KH3-4氨基酸結構域交互(Fig. 2i)。采用ISH和免疫熒光(IF)進行共定位，證實ZFAS1和IMP2的表達分布一致，在HCT116和SW620細胞中都顯示主要分布在細胞質中，部分分布在細胞核中(Fig. 2j)。此外，RIP實驗發現，m6A抗體孵育得到了富集的ZFAS1 (Fig. 2k)。此外，作者合成了包含RGGAC/ rach識別motif (ZFAS1 m6A-WT)以及含有相應的突變序列(ZFAS1 m6A-Mut)的具有生物素標記的ZFAS1探針(Fig. 2m)。然后通過RNA-down實驗證實IMP2蛋白結合的是ZFAS1 m6A-WT，但不是ZFAS1m6A -Mut，而這種富集在IMP2敲低之后會消除(Fig. 2m)，表明m6A識別基序與IMP2蛋白特異性結構域直接結合相互作用。

為了確認ZFAS1是否由IMP2 KH3-4結構域識別m6A基序，用IMP2 KH3-4 WT或Mut載體處理HEK-293 T細胞后進行qPCR檢測，用IMP2 KH3-4 Mut載體處理后，ZFAS1表達明顯減少(Fig. 2l)。隨后，我們對ZFAS1上的m6A位點(+833 ~ +869)進行突變，檢測ZFAS1的穩定性，其穩定性也顯著降低（Fig. 2n）。到目前為止，已經證實了IMP2通過KH3-4直接與ZFAS1的m6A位點結合，增強了ZFAS1的穩定性(Fig. 2a)。

Fig2 IMP2通過直接與ZFAS1的m6A位點結合來提高ZFAS1的穩定性

3、IMP2通過調節ZFAS1在結直腸癌細胞中的表達進而調節生物學特性

在本研究中，為進一步闡明IMP2和ZFAS1在CRC細胞中了調控模式，通過MTT檢測在HCT116 和SW620 CRC細胞系中分析了干擾IMP2表達后細胞的增殖能力(Fig. 3b)和集落形成能力(Fig. 3C)。不出所料，異位表達的IMP2顯著促進了HCT116和SW620細胞的細胞生長和菌落形成能力，IMP2缺失抑制了這兩種類型的結直腸癌細胞的增殖能力和結腸能力（Fig. 3b, c）。此外，通過Trans-well實驗檢測其侵襲能力，結果顯示當沉默IMP2時，遷移細胞被顯著抑制。相反，IMP2過表達顯著提高了HCT116和SW620 CRC細胞的侵襲能力(Fig. 3d)。此外，IMP2敲除增加了細胞凋亡率。然而，經過流式細胞PE / 7 AAD雙重染色后檢測顯示，在HCT116和SW620 CRC細胞中，IMP2過表達顯著抑制了細胞凋亡率(Fig. 3e)。

為進一步確立IMP2是否影響ZFAS1在CRC細胞中的表達及其可能的生物學功能，通過在IMP2敲低的CRC細胞中增強ZFAS1的表達進行挽救實驗。結果顯示ZFAS1過表達逆轉了HCT116和SW620 的分子特征包括細胞增殖能力、細胞集落形成能力、細胞遷移能力和凋亡率(Fig. 3f)。因此，這些結果表明IMP2通過促進ZFAS1的穩定性和表達，促進CRC細胞增殖，抑制CRC細胞凋亡，促進細胞侵襲轉移，而IMP2可以通過調節ZFAS1的表達來恢復其對細胞表型的影響。

Fig3 IMP2通過調節結直腸癌細胞中ZFAS1的表達介導生物學特性

  
4、在CRC細胞中，IMP2通過OLA1作為穩定ZFAS1的關鍵靶點

為挖掘ZFAS1下游影響CRC細胞表型和功能的靶點，對結直腸癌細胞進行相關功能研究。首先，通過熱圖聚類分析，富集了與ZFAS1過表達呈正相關的潛在下游靶點(Fig. 4b) 并且通過結合GSE128435和TCGA數據集進一步擴展CRC樣本(Fig. 4a)。發現線粒體能量代謝相關基因OLA1恰好出現在這些共表達靶點的交叉部位(Fig. 4a)。進一步檢測發現與HIEC對照相比，OLA1在7個CRC細胞株中顯著過表達，包括SW480、HT29、LOVO、CACO2、SW48、HCT116和SW620(Fig. 4c)。通過qPCR檢測發現，與癌旁組織相比，CRC組織中OLA1水平升高(Fig. 4d)。

采用TMA和IHC檢測OLA1表達水平，如預期的那樣，標記的OLA1水平在CRC組織與那些匹配的腫瘤鄰近對照相比，顯示了一個致癌基因的特性(Fig. 4e, f)。OLA1表達量與ZFAS1表達量呈線性正相關(Fig. 4g)。同樣，在TCGA中，OLA1和ZFAS1在CRC組織中的表達高度一致，呈線性正相關(R2 = 0.27, P < 0.0001)。臨床病理參數的相關性分析證實，OLA1低表達的患者在存活的患者中比例較高(Fig. 4h)。而OLA1的高表達顯著縮短了患者無病生存期以及總生存期(Fig. 4i)。為了驗證OLA1確實是被IMP2穩定的ZFAS1的下游靶點，我們檢測了干擾IMP2后OLA1的mRNA和蛋白表達情況。有趣的是，IMP2沉默/過表達不僅降低/增加了OLA1 mRNA的表達，同時也降低或增加了OLA1的表達。然而，IMP2對OLA1的影響可以被ZFAS1完全逆轉(Fig. 4j–l)。因此，這些發現表明在人結直腸癌細胞和組織中，m6A修飾和m6A穩定的ZFAS1表達正調控OLA1。進一步的預后評估表明，OLA1可以作為預測CRC臨床結局的潛在生物標志物。

Fig4 在CRC細胞中，OLA1是經IMP2穩定的ZFAS1的下游關鍵靶點

5、ZFAS1通過與OLA1 OBG型功能域結合，增強OLA1活性并激活糖酵解

在之前的研究中，我們已經確定ZFAS1與OLA1的表達呈正相關。然而，依然未明確ZFAS1與OLA1的相互作用途徑。于是作者通過ISH和IF進行檢測，細胞共定位顯示，OLA1和ZFAS1不僅在HCT116和SW620 CRC細胞的細胞質中分布一致，而且在細胞核中分布一致(Fig. 5b)。為了確定ZFAS1與OLA1是否有直接的結合位點，并檢測ZFAS1中關鍵m6A位點對OLA1的影響，作者將ZFAS1中的3個A堿基(+833 ~ +869)替換為U堿基，并重新預測ZFAS1的三級結構。結果發現ZFAS1-WT和ZFAS1-Mut都與OLA1 OBG型功能域結合，然而，ZFAS1-WT和OLA1的結合強度遠遠高ZFAS1-Mut和OLA1的結合。此外，ZFAS1-WT與OLA1結合充分暴露OLA1的ATP結合位點(NVGKST, 32-37) (Fig. 5c)。

此后，Pull down實驗表明，是ZFAS1-WT探針，但非ZFAS1- mut與OLA1結合，當ZFAS1上的m6A位點(+833 ~ +869)發生突變時，ZFAS1- wt探針不能再拉下OLA1 (Fig. 5d)。當ZFAS1的關鍵m6A位點發生突變時，ZFAS1對OLA1 atp酶活性的恢復效果消失(Fig. 5e)。這也證明了ZFAS1對OLA1 ATP酶活的促進作用取決于ZFAS1與OLA1結合暴露OLA1的ATP結合位點。

為了探討OLA1 ATP酶活性變化對CRC細胞能量代謝的影響，作者檢測了HCT116和SW620細胞中乳酸和ATP含量。結果發現，OLA1表達的降低不僅可以減少結直腸癌細胞中乳酸積累，還可以降低細胞中ATP含量；然而，ZFAS1 -WT能恢復OLA1不足帶來的影響 (Fig. 5f, g)。這一結果與OLA1的ATP水解功能相矛盾，于是推測ATP產生的主要途徑是否被阻斷了。為了驗證這一推測，作者進行了細胞外酸化率實驗，以檢測OLA1的變化對CRC細胞糖酵解能力的影響。結果發現，降低OLA1的表達可顯著降低CRC細胞的糖酵解能力，而ZFAS1-WT而可以恢復OLA1表達減少對CRC細胞糖酵解能力降低的影響(Fig. 5h)。

綜上所述，ZFAS1可以直接與OLA1的OBGtype功能域結合，暴露OLA1上的ATPbinding位點，從而增強OLA1的ATP水解能力。OLA1增強ATP水解能力，促進乳酸的積累和ATP合成原料的釋放，從而激活CRC細胞的糖酵解途徑，最終促進CRC中能量的釋放。

Fig 5 ZFAS1通過與OLA1 OBG型結構域結合增強OLA1活性并激活糖酵解

6、線粒體能量代謝受IMP2-ZFAS1-OLA1信號轉軸的影響

為了進一步闡明在CRC進展過程中參與線粒體能量代謝的IMP2穩定信號軸的關鍵功能，首先在電子顯微鏡下觀察了IMP2沉默后線粒體的形態學變化。結果顯示，在CRC細胞中，IMP2沉默后，線粒體明顯腫脹和受損，線粒體形態恢復正常(Fig. 6b)。也就是說，在CRC中，大多數細胞只能依賴糖酵解提供能量，而IMP2沉默后，CRC細胞的糖酵解能量比例會顯著降低。為了驗證我們的猜想，我們首先用IMP2進行干預，檢測HK2（糖酵解的關鍵蛋白質）和PDHA1（氧化磷酸化的關鍵蛋白）的表達。結果顯示，IMP2過表達促進HK2表達，抑制PDHA1表達(Fig. 6c)。IMP2沉默可顯著降低HCT116和SW620 CRC中HK2的表達，增加PDHA1的表達(Fig. 6c)。此外，在CRC細胞中，ZFAS1沉默/過表達及IMP2過表達/沉默后，HK2和PDHA1的表達水平恢復(Fig. 7d)。IMP2過表達顯著促進乳酸釋放，提高ATP含量，然而，敲低IMP2導致乳酸和ATP含量的釋放顯著減少，而ZFAS1可以完全逆轉IMP2的作用(Fig. 6e, f)。細胞能量代謝檢測進一步表明，IMP2沉默降低了細胞的糖酵解能力，而ZFAS1可以逆轉IMP2沉默對這兩種類型的CRC細胞糖酵解水平降低的影響。綜上所述，這些發現揭示了在CRC發生和發展的過程中，IMP2通過ola1調節ATP水解和糖酵解介導線粒體能量代謝促進m6A表達。

Fig6 線粒體能量代謝受IMP2-ZFAS1-OLA1信號轉軸的影響

7、IMP2在體內通過穩定ZFAS1促進細胞增殖

為確認IMP2-ZFAS1-OLS1軸在體內的生物學功能，將4周齡BALB/c裸鼠腋窩皮下接種4種穩定共轉染HCT116細胞(5 × 106細胞) 建立異種移植模型，分別為shNC組、shIMP2組、shIMP2 + pcDH組、shIMP2 + ZFAS1組(Fig. 7a)。在這項研究中，移植后10天出現了一個明顯的異種移植瘤，在第40天切除異種移植瘤或隨訪至死亡(Fig. 7a)。預后評估顯示，在shIMP2和ZFAS1載體共轉染后，異種移植小鼠的生存時間顯著縮短(Fig. 7b)，提示IMP2與ZFAS1在CRC預后評估中具有協同作用。此外，轉染了shIMP2載體的異種移植小鼠的腫瘤體積、大小和重量均顯著降低，然而，與shIMP2和ZFAS1共轉染后，觀察到顯著增加(Fig. 7c–e)。結果表明，在異種移植小鼠模型中，ZFAS1過表達顯著逆轉了IMP2沉默對腫瘤生長的抑制作用。同樣，在第0、10和40天采集的具有代表性的異種移植物進行研究也得到了相同的結論(Fig. 7f)。

ISH和IHC檢測證實，在異種移植瘤中，shIMP2組和shIMP2 + pcDH組的ZFAS1和OLA1表達較NC組明顯降低；而shIMP2 + ZFAS1組與NC組無顯著差異(Fig. 7g)。同樣，qPCR和WB檢測也得到相同的結論，包括在異種移植瘤中與shIMP2和ZFAS1載體共轉染后的ZFAS1和OLA1(圖7 h-j)。總之，體內實驗表明敲低IMP2通過誘導m6A穩定性，能促進 IMP2與ZFAS1/OLA1軸的相互作用，抑制異種移植物的腫瘤生長。

Fig7 IMP2在體內通過穩定ZFAS1促進細胞增殖

本文發現在CRC增殖和進展過程中，m6A 閱讀器IMP2與長鏈非編碼RNA (lncRNA) ZFAS1以m6A調節依賴的方式進行調控，隨后增加了Obg-like ATPase 1 (OLA1)的募集以及三磷酸腺苷(ATP)水解和糖酵解。

參考文獻：

Lu, S., et al., N6-methyladenosine reader IMP2 stabilizes the ZFAS1/OLA1 axis and activates the Warburg effect: implication in colorectal cancer. J Hematol Oncol, 2021. 14(1): p. 188.