外泌體microRNAs (miRNAs)與多種腫瘤的發展和進展有關；然而，它們是否于髓母細胞瘤(MB)的發生仍有待闡明。在此，有研究發現外泌體miR-101-3p和miR-423-5p在兒童MB的發病中起重要作用，該研究于2021年7月發表在《Cell Death and Differentiation》，IF：15.828。

技術路線：

主要研究結果：

1.       MB患者血漿來源的外泌體中miR-101-3p和miR-423-5p水平上調，這些miRNA可通過外泌體轉移到腫瘤細胞中

在初步篩選中，使用超離心法從MB患者(n = 4)和年齡匹配的健康對照組(n = 4)的血漿中分離出外泌體。通過透射電子顯微鏡分析分離出的外泌體，以確定外泌體的平均大小和形態，顯示出典型的直徑為150 nm的雙層球形結構(圖1A)。通過western blot檢測了外泌體標志物CD9、CD63和GM130的表達。分離的顆粒外泌體核心蛋白標記CD9和CD63陽性，順式高爾基標記GM130陰性(圖1B)。

通過miRNA-seq研究了血漿外泌體的miRNA表達譜。使用1.5倍的變化作為閾值來定義上調或下調的miRNA，與健康對照組相比，MB患者中有35個miRNA上調，5個miRNA下調(圖1C)。然后選擇p值<0.05進一步縮小差異miRNAs的表達范圍，發現MB患者血漿來源的外泌體中miR-101-3p、miR-320b-3p、miR-20a-5p和miR-423-5p的表達高于健康對照組血漿來源的外泌體(圖1D)。通過實時定量PCR (qPCR)檢測了miRNA的表達水平。與健康對照組相比，MB患者血漿來源的外泌體中miR-101-3p和miR-423-5p的表達上調(圖1E)。另外，比較了MB患者和健康對照組外周血單個核細胞中miR-101-3p和miR-423-5p的表達，發現MB患者外周血單個核細胞中miR-101-3p和miR-423-5p的表達水平更高(圖1F)。

為了確定血漿來源的外泌體是否能轉移到受體腫瘤細胞，用從MB患者分離的PKH67標記的外泌體培養Daoy（MB細胞系）細胞24小時。隨后的共聚焦顯微鏡分析證實癌細胞細胞質中存在PKH67標記的外泌體，這意味著外周血來源的外泌體可被腫瘤細胞內化（圖1G）。在使用來源于MB患者血漿的混合外泌體培養Daoy細胞后，miR-101-3p和miR-423-5p的表達水平均上調，而使用來源于健康對照血漿的外泌體培養后，未觀察到顯著變化（圖1H）。這些結果表明，miR-101-3p和miR-423-5p在來源于MB患者血漿的外泌體中富集，并可通過這些外泌體輸送到腫瘤細胞。

2. miR-101-3p和miR-423-5p在MB細胞中具有抑癌作用

使用CCK-8分析了miR-101-3p和miR-423-5p對MB細胞增殖能力的影響。與對照組相比，Daoy和D283 Med細胞中miR-101-3p或miR-423-5p的過度表達導致腫瘤細胞增殖率降低（圖2A，B）。通過CCK-8分析，進一步評估了添加來自MB患者血漿的外泌體（50μg/ml）對Daoy和D283 Med細胞增殖的影響，結果表明，兩種細胞系的腫瘤細胞的增殖能力均受到顯著抑制（圖2C）。通過流式細胞術分析研究了miR-101-3p和miR-423-5p對細胞凋亡的影響。與陰性對照組相比，任一miRNA的過度表達導致Daoy和D283 Med細胞的凋亡率顯著增加（圖2D，E）。

遷移和侵襲實驗發現，miR-101-3p或miR-423-5p的過度表達抑制Daoy細胞的侵襲和遷移能力（圖2F-H）。綜上所述，這些數據證實miR-101-3p和miR-423-5p在MB細胞中發揮抗腫瘤作用，并且miRNA的上調可以抑制MB細胞增殖、遷移和侵襲，同時也促進細胞凋亡。

3. 單核細胞/巨噬細胞來源的外泌體miR-101-3p和miR-423-5p可轉入MB細胞

前面發現miR-101-3p和miR-423-5p在MB患者血漿分離的PBMCs和外泌體中均上調(圖1E, F)，而這兩種miRNAs在腫瘤組織中的表達均低于相鄰正常腦組織(圖3A)。這表明含有這兩種mirna的外泌體來自免疫細胞而不是腫瘤細胞，是對腫瘤的免疫反應的結果。巨噬細胞來源的外泌體占血液中循環微泡的很大比例。為了確定含有miR-101-3p和miR-423-5p的外泌體的來源，從THP-1單核細胞培養上清中分離出外泌體，并檢測miR-101-3p和miR-423-5p的表達。發現miR-101-3p和miR-423-5p在分離的外泌體中的表達高于THP-1細胞(圖3B)。用轉染miR-101-3p/miR-423-5p模擬物或miR-NC的THP-1細胞衍生的外泌體培養Daoy細胞，觀察到這些外泌體也可以轉移到Daoy細胞中，并且培養后miR-101-3p和miR-423-5p的表達水平較高（圖3C，D）。與對照組相比，來自轉染miR-101/miR-423模擬物的THP-1細胞上清液的外泌體顯著抑制Daoy細胞的增殖能力（圖3E）。進一步用轉染miR-101-3p/miR-423-5p模擬物或miR-NC（陰性對照）的THP-1單核細胞培養上清液培養Daoy細胞，發現Daoy細胞的增殖能力受到顯著抑制，而用含有GW4869的培養基培養后未觀察到顯著變化（40μM；一種抑制外泌體分泌的中性鞘磷脂酶抑制劑）（圖3F）。這些結果表明，對細胞增殖的影響至少部分是由于外泌體的存在，并且這些影響可以通過GW4869處理部分逆轉。與THP-1細胞類似， HMO6細胞也可以分泌含有miR-101-3p和miR-423-5p的外泌體（圖S4A D）和存在于MB組織中的CD68+細胞（圖3G）。從MB患者和健康對照組的外周血中分離出CD14+單核細胞，并將其培養72小時。與對照組相比，MB患者來源的CD14+單核細胞培養上清液中的外體miR-101-3p和miR-423-5p的表達更高（圖3H）。總之，這些結果表明MB患者的單核巨噬細胞分泌含有miR-101-3p和miR-423-5p的外泌體，這些外泌體可以轉移到MB細胞。

4. FOXP4是miR-101-3p和miR-423-5p的靶點

使用TargetScan和RNA22預測工具確定了它們的潛在靶點。確定了6個在兩個數據庫中均被miRNA調控的基因作為潛在靶標進行評估，分別是FOXP4、PLCB1、ANKRD52、ANGPTL2、DLGAP3和DCUN1D3(圖4A)。由于FOXP4 (forkhead box P4)已知在胚胎發育和腫瘤發生中有作用，因此選擇該基因進行進一步研究。經western blotting檢測，轉染miR-101-3p或miR-423-5p的Daoy細胞顯示內源性FOXP4蛋白表達降低(圖4B, C)。此外，HEK293T細胞中的熒光素酶報告基因檢測顯示，這兩種miRNA的過表達均顯著抑制FOXP4-3’UTR驅動的熒光素酶活性；然而，miR-101-3p或miR-423-5p與突變的FOXP4-3’UTR共轉染后，熒光素酶活性未見顯著變化(圖4D)。這表明FOXP4可能是MB中miR-101-3p和miR- 423-5p的直接和功能靶點。

5. FOXP4在MB細胞中起致癌基因的作用

通過real-time qPCR檢測發現FOXP4在MB腫瘤組織中的表達水平高于相鄰腦組織樣本(圖5A)。為了進一步闡明靶向FOXP4是否可以介導MB腫瘤進展，在Daoy細胞中進行了一系列功能檢測。使用siRNA抑制FOXP4表達(圖5B)導致細胞增殖、遷移和侵襲減少，而細胞凋亡率增加(圖5C-H)。綜上所述，這些結果表明FOXP4可能是MB腫瘤發生中的致癌基因，并且可能是miR-101-3p和miR-423-5p的靶點。

6. EZH2在MB腫瘤組織中上調，是miR-101-3p的功能靶點，在MB腫瘤進展中作為癌基因

由于在體外觀察到miR-101-3p對Daoy細胞的抑制作用似乎強于miR-423-5p(圖2A)。這提示miR-101-3p也可能靶向FOXP4以外的基因。通過生物信息學分析，發現EZH2是miR-101-3p的另一個假定靶點。

如圖6A所示，腫瘤組織中EZH2 mRNA的相對表達顯著高于鄰近正常組織。TargetScan數據庫中調查處EZH2 3’-UTR中存在miR-101-3p的匹配位點，并采用雙熒光素酶報告子分析來確認miR-101-3p和EZH2表達水平之間的相關性。如圖6B所示，miR-101-3p模擬物的轉染降低了野生型EZH2 3’-UTR驅動的熒光素酶活性，而在以突變形式轉染后未觀察到顯著變化，這表明miR-101-3p可以通過直接結合其3’-UTR中的位點來抑制EZH2的表達。瞬時轉染miR-101-3p也降低了Daoy細胞中EZH2 mRNA和蛋白質水平（圖6C，D）。

接下來，為了研究EZH2在MB中的功能，同樣使用siRNA敲除其在Daoy細胞中的表達(圖6E)。功能分析顯示，EZH2的下調抑制MB細胞活力、遷移和侵襲，同時促進MB細胞凋亡(圖6F-K)。綜上所示，這些結果表明，miR-101-3p可以直接靶向EZH2和FOXP4抑制MB。

7.     miR-101-3p或miR-423-5p過表達抑制體內腫瘤的發生

為了評估miR-101-3p和miR-423-5p在體內的抗腫瘤作用，將轉染LV16-miR-101-3p、LV16-miR-423-5p或LV16-NC（陰性對照）的Daoy細胞（5 106）皮下注射到雄性Balb/c裸鼠體內，并每周測量產生的腫瘤體積。通過RT-qPCR測定轉染慢病毒的Daoy細胞中miR-101-3p和miR-423-5p的相對表達水平（圖7A）。注射后2周可觸及腫瘤，植入后7周處死小鼠（圖7B，C）。與對照組相比，LV16-miR-101-3p和LV16-miR-423-5p治療組的腫瘤生長受到顯著抑制（圖7C，D）。如圖7E所示，使用miR-101-3p或miR-423-5p治療后，腫瘤重量也顯著降低。通過免疫組織化學評估了EZH2、FOXP4和Ki-67在異種移植腫瘤組織中的表達。與對照組織相比，表達LV16-miR-101-3p和LV16-miR-423-5p的腫瘤組織中FOXP4和Ki-67的水平均下調（圖7F，G），而表達LV16-miR-101-3p的腫瘤組織中EZH2的水平也下調?？傊@些數據表明miR-101-3p和miR-423-5p通過抑制FOXP4和EZH2的表達來抑制體內腫瘤生長。

 主要結論：

綜上所述，作者確定了兩種外泌體的miRNAs， miR-101-3p和miR-423-5p在體外和體內均是MB細胞增殖、遷移和凋亡的關鍵調控因子，并確定這些作用是通過與FOXP4-3’UTR直接結合而發揮的。進一步發現miR-101-3p也可以靶向EZH2。這些數據為MB的治療提供了一種新的治療策略(圖8)。