肥胖是癌癥惡化的一個重要風險因素，與肥胖相關的癌癥是導致死亡的主要原因之一。然而，在受肥胖影響的患者中，賦予癌細胞轉移特性的分子機制仍未被探索。在此，有作者通過重編程結腸癌(CRC)的4個共識分子亞型(CMS)，研究了內臟脂肪組織(VAT)在CRC細胞間質表型調控中的旁分泌效應，證明了微環境細胞因子是預測肥胖相關癌癥患者腫瘤行為的重要預后分子。該研究于2021年8月發表在《NATURE COMMUNICATIONS》，IF:12.121。

技術路線：

主要研究結果：

1. 內臟脂肪基質細胞促進CR-CSphCs的致瘤性和轉移活性

為了證實肥胖對癌細胞生物學行為的臨床影響，作者首先評估了脂肪組織在CRC進展中的潛在作用，以及健康體重(18.50 < BMI < 25)或受肥胖影響(BMI > 30)。對大腸癌患者隊列的薈萃分析顯示，肥胖與生存概率呈負相關（圖1a）。這種相關性也被一項大型隊列CRC患者的無進展生存(PFS)分析所證實，該分析認為BMI是獨立于分期和治療的陰性預后因素(圖1b)。對患有肥胖癥的大腸癌患者腫瘤切片的免疫組化分析強調，脂聯素高表達的脂肪細胞位于腫瘤浸潤前沿，分布在表達CDX2的腫瘤細胞之間，覆蓋了整個腫瘤腫塊的28% (圖1 c)。同樣，肥胖患者的大腸癌肝轉移在轉移灶邊緣，瘤周出芽附近顯示出明顯的脂肪細胞。在瘦肉型患者的原發性和轉移性結直腸癌組織中未觀察到這種現象(圖1 c)。瘦CRC患者的腫瘤標本顯示有表達內皮表型CD34 + / CD31 + /CD45的細胞(圖1d)。體外限制稀釋試驗表明，用V-ASC釋放因子處理可提高大量和富集的Wntlow-CRCSPCs的球形起始細胞頻率，重現Wnthigh細胞的克隆形成潛能（圖1e-g）。這一現象與Wntinactive (GFP-)細胞向Wntactive (GFP +)細胞的轉化相平行，證實了Wnt信號通路在CRC干細胞相關重編程中的關鍵作用(圖1h)。V-ASCs與CR-CSphCs共注入小鼠腎包膜下后，致癌細胞的頻率增加了 (圖1 i)。與更明顯的侵襲潛能相一致，在V-ASCs存在的體內限制稀釋試驗顯示，即使在少量細胞被移植時，CMS2 CR-CSphCs也能產生轉移到肝臟和肺部的病變(圖1j)。這些數據表明ASCs和CRC細胞之間存在支持癌癥進展的串擾。

圖1浸潤腫瘤的VAT提高了CSphCs的轉移潛能

2. IL-6和HGF增加了CD44v6 + CR-CSCs的數量，產生NGF，有利于內臟ASCs的遷移能力和內皮轉分化

為了確定VAT促進轉移的關鍵分子，接下來研究V-ASCs釋放的細胞因子是否會影響CR-CSphCs的轉移特性。與SASCs、CR-CSphCs和原代脂肪組織細胞(AT)相比，從肥胖CRC患者中分離出來的V-ASCs產生的IL-6和HGF更豐富 (圖2a)。IL-6和/或HGF的存在增強了CR-CSphCs的增殖能力和集落形成潛能(圖2b, c)，同時獲得侵襲表型以及干細胞和轉移相關基因的表達，如WNT5A、WNT5B、WNT7A、MMP2、MMP9、TWIST、NODAL、SDF1和ZEB2 (圖2d、e)。IL-6和HGF增加了ZEB2蛋白的表達，與其mRNA水平的上調一致(圖2f)。此外，阻斷IL-6和/或HGF可消除VASCS釋放蛋白誘導的CR-CSphCs的細胞增殖和遷移活性(圖2g, h)。因此，釋放到V-ASC CM中的V-ASC衍生的IL-6和HGF顯著促進CD44v6的表達(圖2i)，CD44v6是一種識別具有強大轉移潛能的結直腸癌細胞的標記物，甚至誘導CD44v6球形細胞獲得CD44v6表達(圖2j)。由于ASCs以CD271的表達為特征，作者評估了其配體(由CSCs產生)在ASCs募集中的作用。與其他CD271配體家族成員BDNF和NTF4(圖2k)相比，CD44v6+細胞表達高水平的神經生長因子(NGF)和NTF3 mRNA，并分泌NGF和NT-3，而這些神經營養素很少被CD44v6-細胞釋放，除非暴露于V-ASC的CM(圖2l)。CD44v6+細胞釋放的NGF和NT-3促進ASCs募集，與NGF中和抗體的較弱作用相比，CD271中和抗體可完全阻止ASCs募集(圖2m)。此外，暴露于V-ASC CM的CR-CSPCs也能夠吸引ASC(圖2m，n)。因此，這些數據表明，ASC衍生的IL-6和HGF可以將CD44v6-初始細胞重新編程為CD44v6+細胞，從而通過分泌NGF和在腫瘤腫塊內招募ASC來增加其轉移潛能。

圖2脂肪源性因子擴大了分泌NGF的CD44v6 +細胞片段，增強了ASCs的遷移能力

CD44v6 +細胞表達并產生高水平的VEGF，增加了ASCs的增殖率(圖3a, b)。另外，大多數CD271 + ASCs表達VEGFR(圖3c)，提示CD44v6 +細胞來源的VEGF可能觸發ASCs的血管生成信號。CD44v6+細胞的旁分泌活性誘導富集的CD34+/CD31 ASC向表達CD31的內皮樣細胞轉分化(圖3d)。此外，暴露于CD44v6+細胞釋放的CM導致HUVEC內皮細胞形成血管小管，類似于VEGF治療后形成的血管小管（圖3e和補充圖3d）。在共注射CR-CSphCs和V-ASCs生成的結CRC異種移植物中，與更明顯的血管密度相關的CD44v6 +細胞優先定位在血管前部(圖3f)，這些發現表明CSC腔室參與了新血管生成和已有毛細血管的新生萌芽。

3. 內臟釋放蛋白誘導CR-CSphCs的EMT

CR-CSphCs暴露于V-ASC CM中，證實了釋放蛋白在觸發轉移途徑中的重要作用，將轉錄組結構從上皮/CMS2模式轉變為類似于間質CMS4的表型(圖3g)。同樣，對單獨使用V-ASC CM或培養基處理的CR-CSphCs進行的RNA-Seq轉錄組分析顯示，有10個DEGs與CMS4特征相關(圖3h)。IL-6和HGF靶向消除VAT誘導的轉移活性，恢復CMS2 CR-CSphCs的非轉移表型(圖3i)。這些結果表明V-ASCs旁分泌活性驅動CRC球細胞向間充質樣表型轉變，賦予它們轉移潛能。

圖3 VEGF誘導ASCs內皮分化，激活CRC球細胞EMT程序

4. VAT通過調控ZEB2表達來管理EMT

利用分子特征數據庫(MSigDB)進行的基因集富集分析(GSEA)顯示，與代謝途徑相關的基因呈負富集，與EMT程序相關的基因呈正富集(圖4a)。上調E-box結合同源盒(ZEB)轉錄因子ZEB1和ZEB2，與釋放的蛋白重編程CMS2 CR-CSphCs向轉移前表型的能力一致(圖4b)。在V-ASC CM處理的CMS4和CMS2 CR-CSphCs中，有15個基因表達上調，6個基因表達下調(圖4c)。在V-ASCs細胞因子的誘導下，ZEB1和ZEB2的mRNA和蛋白水平均上調(圖4d, e)，有報道稱ZEB1和ZEB2可調節miR-200家族成員的表達并調節CRC中的EMT。對miRNA表達譜分析顯示，V-ASC CM處理后，CMS2 CR-CSphCs中miRNA-200家族成員，特別是miR-200a的表達下調，顯示出與CMS4 CR-CSphCs相似的miRNA水平(圖4f)。在使用V-ASCs CM處理的CR-CSphCs中，對大多數差異表達mirna網絡及其靶標的分析表明，ASC釋放的蛋白調控了大量聚集在miR-200a/ZEB成員軸上參與EMT過程的基因(圖4g)。在V-ASC CM作用下，CMS2細胞中ZEB2蛋白的表達水平與CMS4細胞中相似(圖4h)。此外，外源表達ZEB2可促進vimentin和CD44v6的表達，并增強腫瘤向遠處器官的擴散(圖4i、j)，表明ZEB2可能作為具有轉移特性的CRC細胞的功能標記物。總之，這些結果表明ZEB2是具有轉移潛能的CRC的功能性生物標志物。

圖4 V-ASCs增強ZEB2的表達，維持CR-CSPCs的轉移活性

5. IL-6/HGF阻斷降低VAT誘導的轉移形成

GSEA顯示，V-ASC釋放因子促進了CR-CSPCs中STAT3激活途徑相關基因的富集(圖5a)。免疫印跡分析顯示，V-ASC CM和IL-6/ HGF均通過增強酪氨酸和絲氨酸殘基中STAT3的磷酸化來激活CMS2細胞中的STAT3通路(圖5b)。根據結腸腫瘤切片免疫組化分析，STAT3的激活主要位于肥胖CRC患者的脂肪組織附近，細胞核染色突出。而在瘦骨嶙峋的患者中，與腫瘤間質接觸的癌細胞表現出核p-STAT3的微弱存在(圖5c)。STAT3磷酸化抑制劑C188-9降低了由IL-6和HGF共同維持的STAT3的激活(圖5d)。此外，在IL-6和HGF的存在下，C188-9顯著降低了細胞增殖率和克隆活性，并恢復了CR-CSphCs中miR-200a和ZEB2的表達水平(圖5e h)。同樣，暴露于IL-6和HGF的CMS2 CR-CSphCs，其細胞形態發生了變化，獲得了與拉長形狀相關的獨特極化，而暴露于C188-9則減弱了這種極化(圖5i)。這些結果表明，脂肪微環境細胞因子通過STAT3/miR-200a/ZEB1/2軸驅動上皮相關CMS2 CR-CSphCs獲得間充質表型。

圖5 IL-6和HGF通過激活STAT3誘導間質表型

托西珠單抗和克唑替尼的聯合治療能夠恢復V-ASC CM對CR-CSphCs增殖和集落形成能力的影響(圖6a, b)。此外，這種雙靶點治療阻礙了v - asc誘導的miR- 200a下調，從而降低了ZEB1和ZEB2的表達，并降低了CMS2 CR-CSphCs的獲得性侵襲行為(圖6c-e)。為了確定托西珠單抗聯合克唑替尼是否可以用于輔助治療，防止內臟肥胖誘導的轉移形成，將CMS2 crcsphc和V-ASCs共注射到小鼠脾臟中產生轉移性小鼠替身。脾切除術后5天，小鼠每周治療3次，持續3周(圖6f)。，這種治療方案顯著降低了V-ASC刺激的CMS2細胞的轉移性植入頻率，即使是在治療暫停8周后(圖6g)。此外，對112例CMS2 CRC患者的隊列分析顯示，ZEB2表達與RFS概率顯著負相關(圖6h, i)，提示ZEB2可能是一個推測的預后因素，可能與肥胖影響的癌癥患者相關。

圖6 IL-6和HGF靶向抑制CR-CSphCs VAT誘導的轉移能力

主要結論：

作者發現通過抑制STAT3 (C188-9)、IL-6R(托西利珠單抗)或c-MET(克唑替尼)靶向JAK/STAT通路的激活，會損害CMS2 CR-CSphCs的VAT驅動轉移促進活性(圖6i)。因此，由于脂肪釋放因子通過確定慢性炎癥狀態和增加遠處轉移形成的風險來促進CRC微環境的形成，這些藥物的臨床可用性可以被考慮作為肥胖相關癌癥患者的輔助治療策略。