tRNA衍生的小RNA (tDRs)廣泛分布于血液和尿液等人體組織中，在癌癥的進展中發揮著重要作用。然而，tDRs在結直腸癌(CRC)血漿中的表達及其潛在的診斷價值尚未得到系統的探討。目前有作者發現血漿中5'-tRF-GlyGCC的表達水平是一種很有前景的CRC診斷生物標志物，該研究于2021年2月發布在《Genome Medicine》，IF：10.675。

技術路線：

主要研究結果：

1. 大腸癌CRC和健康志愿者HC血漿中tDRs的表達譜

為了研究tDRs在CRC和HC血漿中的表達譜，作者使用小RNA高通量測序分析了3名CRC和3名HC受試者血漿樣本(表S1)中10 - 50 bp范圍內的小RNA (smRNA)。分析表明，在HCs和CRC血漿中，tDRs的豐度按5’-tRF>5’-half/i-tRF>3’-tRF>3’-half的順序降低（圖1a）。此外，大腸癌血漿中5-tRF的比例顯著高于HCs（圖1a），表明5’-tRF可能參與大腸癌的發生和進展。進一步分析單個tDR譜的表達。分層聚類顯示HCs和HCs之間血漿中tDR表達存在系統性差異（圖1b），分別在CRC和HCs中獲得628和745個tDR。進一步分析CRC和HC血漿中5 -tRFs的差異。結果顯示，CRC血漿中的5' -tRF譜與HC血漿中的5 ’-tRF譜有較大差異(圖1c)。例如，HC和CRC血漿中5’ -tRF豐度最高的分別是5’ -tRF- HISGTG和5’ -tRF- GLYGCC。5’-tRF- GLYGCC在HC血漿中占5’ -tRF的7.44%，而在CRC血漿中占5’ -tRF的52.24%。此外，5’-tRF-GlyCCC在CRC血漿中的比例明顯升高;而5’-tRF-HisGTG和5’-tRF-AlaTGC在CRC血漿中的比例明顯降低(圖1c)。所有這些數據表明5’-tRFs在CRC血漿中與在HC中有顯著差異。

在CRC和HC鑒定的628個和745個tDR中，每組分別有85個和202個tDR(圖1d)。此外，CRC患者血漿中81個tDR較HC患者明顯增加(圖1d)。為了驗證小RNA測序結果，對上述3例CRC和3例HC受試者血漿樣本中5例上調的候選tDR進行了qRT-PCR檢測。如圖1e所示，CRC血漿中測量到的tDRs均較HC升高，其中5’-tRF-GlyGCC的升高幅度最大。所有這些數據表明，與HC相比，CRC患者血漿中tDRs的表達譜存在差異;此外，5’-tRF，特別是5’-tRF- glygcc在CRC血漿中顯著升高。

表S1小RNA測序樣本的背景信息

圖1 tDR在CRC和HC血漿中的表達譜

2. CRC患者血漿中5'-tRF-GlyGCC水平

5’-tRF-GlyGCC位于第1、2、6、16、17染色體上，轉錄本長度為31 nt，序列為5’-GCA UGG GUG GUU CAG UGG UAG AAU UCU CGC C-3’ (MINTbase Unique ID: tRF-35- PNR8YP9LON4VN1)。小RNA-seq數據提示5’-tRF-GlyGCC在CRC患者中的升高高于其他tDR。進一步檢測了其在CRC (n = 105)和HC (n = 90)患者血漿中的表達。我們的數據顯示，5’-tRF-GlyGCC在CRC患者中的豐度明顯高于HC (圖2)。然后分析了5’-tRF-GlyGCC在CRC患者不同病理階段(I期，n = 11;階段II, n = 34;III期，n = 32;IV期，n = 25)。結果表明，CRC各階段5’-tRF-GlyGCC含量均高于HC (圖2 b)。結果表明5’-tRF-GlyGCC可能是一種有前景的診斷CRC患者的生物標志物。

5’-Trf-GlyGCC的表達隨著CRC進展而增加(圖2b)。此外，5’-tRF-GlyGCC在I/II期CRC患者中的豐度明顯低于III/IV期患者(圖2c)。轉移組患者血漿5’-tRF-GlyGCC水平明顯高于無轉移組(圖2 d)。CEA≥5 ng/ml組的5’-tRF-GlyGCC水平明顯高于CEA < 5 ng/ml(圖2e)。CRC患者CA199≥37 IU/ml的5’-tRF-GlyGCC水平明顯高于CA199 <37 IU/ml(圖2f)。結果顯示，CRC患者血漿中5’-tRF-GlyGCC水平與CEA(圖2g)和CA199(圖2h)水平顯著正相關。5’-tRF-GlyGCC在結直腸癌患者血漿中上調，并隨著結直腸癌的進展和轉移而升高。

收集16對腫瘤組織和血漿樣本，驗證5’-tRF-GlyGCC在CRC組織和相同患者血漿中的表達是否存在相關性。結果顯示5’-tRF-GlyGCC在血漿中的表達與配對CRC組織中的表達顯著相關(圖2i)。提示血漿中5’-tRF-GlyGCC水平較高的患者在結直腸癌組織中5’-tRF-GlyGCC水平也較高。

圖2 CRC患者血漿5’-tRF-GlyGCC水平

3. 5’-tRF-GlyGCC作為CRC患者的biomarker的診斷價值

為了檢測血漿5’-tRF-GlyGCC水平是否對CRC患者具有診斷價值，ROC曲線以確定臨界值。從圖3a看出，血漿5’-tRF-GlyGCC含量可以區分CRC患者和HC，曲線下面積(AUC)為0.882。5’-tRF-GlyGCC的最佳截斷值為1.9725(敏感性86%，特異性72%)(圖3b)。結果表明，5’-tRF-GlyGCC的診斷價值遠高于CEA (AUC 0.762)和CA199(0.557)。此外，5’-tRF-GlyGCC、CEA和CA199組合的ROC曲線將AUC值提高到0.926 (圖3 c)。聯合的最佳臨界值為3.1273(敏感性86，特異性84%)(圖3d)。這說明血漿5’-tRF-GlyGCC水平對CRC患者具有良好的診斷能力。

圖3 5’-tRF-GlyGCC作為CRC患者的biomarker的診斷價值

4. ALKBH3參與了5’-tRF-GlyGCC的生物發生

LKBH3是一個tRNA去甲基化酶，僅被鑒定為誘導tDRs的生成。為了研究ALKBH3是否參與了5’-tRF-GlyGCC的生物發生。首先，檢測5’-tRF-GlyGCC和ALKBH3在9種人CRC細胞系和人結腸黏膜上皮細胞NCM460中的表達。結果顯示，在大多數測量的CRC細胞系中，5’-tRF-GlyGCC (圖4a)和ALKBH3 mRNA(圖4b)均顯著高于NCM460細胞。同樣，western blot分析證實，在CRC細胞中，ALKBH3蛋白表達上調(圖4c)。此外，5’-tRF-GlyGCC的表達與測量的CRC細胞中ALKBH3的mRNA水平顯著正相關(圖4d)。

過表達ALKBH3可以增加5’-tRF-GlyGCC的表達(圖4 E)。ALKBH3沉默降低了SW480、RKO和PENG-EBV細胞中5’-tRF-GlyGCC的水平(圖4f)。一致地，在RKO和SW480細胞中過表達ALKBH3可以增加5’-tRF-GlyGCC的表達(圖S4 C)，而在HCT15和HCT116細胞中，抑制ALKBH3的表達可以降低5’-tRF-GlyGCC的表達(圖S4 D)。證明了，tRNA去甲基化酶ALKBH3參與了CRC和血細胞中5’-tRF-GlyGCC的生物發生。

圖4 ALKBH3參與了5’-tRF-GlyGCC的生物發生

5. 與CRC細胞共培養可通過ALKBH3增加血細胞5’-tRF-GlyGCC

與所有檢測的CRC細胞共培養可顯著提高PENG-EBV細胞中的5’-tRF-GlyGCC水平。與CRC細胞共培養可顯著提高THP-1細胞中5’-tRF-GlyGCC水平(圖5b)。與所有CRC細胞共培養時，PENG-EBV細胞中ALKBH3 mRNA的表達也明顯增加(圖5c)。western blot分析證實，與CRC細胞共培養提高了PENG-EBV細胞中ALKBH3蛋白的表達(圖5d)。

作者進一步研究了ALKBH3是否參與CRC誘導的血細胞5’-tRF-GlyGCC。ALKBH3在PENG-EBV細胞中的表達被下調(圖5e)。結果表明，缺失ALKBH3可減弱SW620(圖5f)和SW480(圖5g)誘導的PENGE- EBV細胞中5’-tRF-GlyGCC的表達。提示CRC細胞可通過上調ALKBH3上調外周血5’-tRF-GlyGCC水平。

圖5與CRC細胞共培養可通過ALKBH3增加血細胞5’-tRF-GlyGCC

6. 異種移植的CRC腫瘤增加了小鼠血漿中5’-tRF-GlyGCC的水平

為了評價體內CRC腫瘤對5’-tRF-GlyGCC表達的影響，使用BALB/c-nu-nu小鼠建立了人CRC HCT116異種移植瘤。與對照組相比，移植裸鼠血漿5’-tRF-GlyGCC水平顯著升高(圖6)。此外，外周血中ALKBH3 mRNA的表達顯著升高(圖6 b)。小鼠CRC CT26細胞與BALB/c小鼠建立異種移植，結果顯示，外周血中5’-tRF-GlyGCC水平(圖6c)和ALKBH3 mRNA表達(圖6d)顯著。此外，在荷瘤小鼠中5’-tRF-GlyGCC的表達水平與ALKBH3的表達顯著正相關(圖6e)。這些結果表明，CRC異種移植可促進血漿5’-tRF-GlyGCC水平，并伴有體內ALKBH3的上調。

圖6異種移植的CRC腫瘤增加小鼠血漿中5’-tRF-GLYGCC的水平

結論：

該研究顯示了CRC患者血漿中tDR的分布和豐度，并強調5’-tRF-GLYGCC是一種有前景的CRC診斷生物標志物。此外，通過分析帶有細胞的腫瘤小鼠的數據發現，CRC中5’-tRF-GLYGCC的高水平可能是由于tRNA去甲基化酶ALKBH3的上調。需要注意的是，tDRs的組成在不同的腫瘤模型中可能是不同的;5’-tRF-GLYGCC作為生物標志物的作用及其在其他類型癌癥中的致癌作用還需要進一步研究。

參考文獻：

Wu Y, Yang X, Jiang G, Zhang H, Ge L, Chen F, Li J, Liu H, Wang H. 5'-tRF-GlyGCC: a tRNA-derived small RNA as a novel biomarker for colorectal cancer diagnosis. Genome Med. 2021, 13(1):20. doi: 10.1186/s13073-021-00833-x.