外泌體是胞內多泡體與細胞膜融合后，釋放到細胞外的膜性小囊泡，是細胞間信號傳輸的載體。外泌體最近幾年受到廣泛關注，成為生物醫學科學研究的新寵兒。文章發表數目飛速增長，外泌體成為研究熱點是大致可以認為從2014年開始。2013年，諾貝爾生理學或醫學獎授予美國科學家詹姆斯·羅思曼、蘭迪·謝克曼及德國科學家托馬斯·祖德霍夫，以表彰其在細胞間囊泡運輸調控機制領域作出突出貢獻，將外泌體研究的熱度推向高潮。2020年外泌體相關課題中標兩千余項。

但是現階段的外泌體研究主要是與其他研究熱點結合例如，miRNA、lncRNA、circRNA。今天講一下外泌體相關研究。這篇文獻題目為：Warburg effect-promoted exosomal circ_0072083 releasing up-regulates NANGO expression through multiple pathways and enhances temozolomide resistance in glioma。該文章主要講述了外泌體circ_0072083通過調節神經膠質瘤中miR-1252-5p介導的降解和去甲基化來增加NANOG表達，從而促進TMZ抗性。

circ_0072083 豐度在 TMZ 抗性神經膠質瘤組織和細胞中增加

證實替莫唑胺（TMZ，膠質瘤化療藥）抗性組織的 MGMT 啟動子甲基化比例低于 TMZ 敏感樣品。為了探討circ_0072083 是否參與膠質瘤中的TMZ抗性，測量了circ_0072083在抗性和敏感組織中的表達變化。TMZ 抗性組織（n ?= 36）中的circ_0072083 豐度高于敏感組織（n ?= 33）。此外，構建了TMZ抗性細胞系（U251/TR和U87/TR），其 TMZ的IC50 高于敏感細胞。circ_0072083在抗性細胞（U251/TR和U87/TR）中的豐度比敏感細胞（U251和U87）增加了2 倍以上。此外，還分析circ_007208的信息和結構CircView軟件顯示circ_0072083 是ZFR轉錄本的外顯子 2 與外顯子20的反向剪接產生的。此外，在兩種細胞系中，circ_0072083對放線菌素D和RNase R的抗性比相應的線性RNA更強，表明 circ_0072083 的圓形結構。此外，circ_0072083主要在U251/TR和U87/TR細胞的細胞質中表達。為了抑制細胞中的circ_0072083，構建了三種靶向 circ_0072083 剪接點的siRNA，并證實了它們的功效。

circ_0072083 敲低降低了 TMZ 抗性神經膠質瘤細胞中的 TMZ 抗性

為了研究circ_0072083對TMZ抗性的作用，用sh-circ_0072083或sh-NC 轉染U251/TR和U87/TR細胞。用于穩定轉染的sh-circ_0072083是基于具有最高敲低效率的si-circ_0072083#1序列構建的。sh-circ的轉染誘導U251/TR 和 U87/TR 細胞中circ_0072083 水平降低 65% 以上。circ_0072083 敲低明顯降低了 U251/TR 和 U87/TR 細胞中TMZ的IC50。接下來，在用TMZ (50 μg/mL) 處理的細胞中進行功能分析。在TMZ存在的情況下，circ_0072083沉默通過降低增殖和集落形成的能力顯著抑制細胞增殖。此外，在TMZ存在下，circ_0072083干擾明顯增加了U251/TR和U87/TR細胞的凋亡。此外，敲低circ_0072083顯著削弱了通過TMZ攻擊的兩種細胞系的遷移和侵襲能力。此外，在異種移植模型中研究了 circ_0072083對 TMZ 功效的影響。用sh-circ_0072083或sh-NC轉染U251/TR細胞建立異種移植模型，然后用TMZ（20mg/kg）或PBS處理小鼠。與 sh-NC + TMZ 組相比，sh-circ + TMZ 組的腫瘤體積和重量明顯減少。此外，與 sh-NC + TMZ 組相比，sh-circ_0072083 + TMZ 組中的 circ_0072083 豐度顯著降低。這些結果表明，circ_0072083 沉默減弱了膠質瘤中的 TMZ 抗性。

circ_0072083 沉默通過調節 ALKBH5 介導的 TMZ 抗性神經膠質瘤細胞中的去甲基化抑制 NANOG 水平

為了探索ALKBH5和NANOG是否需要通過circ_0072083調節TMZ抗性，在TMZ抗性組織和細胞中檢測了它們的水平。與敏感組相比，TMZ抗性組織和細胞中ALKBH5和NANOG mRNA水平顯著升高。與敏感組相比，TMZ抗性組的NANOG mRNA m6A水平明顯降低。此外，在TMZ抗性組織和細胞中，ALKBH5和NANOG蛋白水平明顯增加。并且使用sh-ALKBH5轉染通過 ALKBH5沉默顯著降低了NANOG 表達。RIP分析顯示NANOG可以在 U251/TR和U87/TR 細胞中被 ALKBH5 富集。此外，ALKBH5沉默明顯增強了NANOG mRNA的m6A水平并降低了響應放線菌素D的NANOG mRNA穩定性。此外，在 U251/TR 和 U87/TR 細胞中評估了circ_0072083對ALKBH5 和NANOG表達的影響。結果表明，circ_0072083 沉默顯著降低了ALKBH5和 NANOG 的豐度，并增加了 NANOG mRNA 的 m6A 水平。顯示多蛋白復合物（METTL3、METTL14 和 WTAP）介導 NANOG mRNA 的 m6A 修飾以誘導其降解。circ_0072083 可以上調 ALKBH5 表達，其介導 NANOG mRNA 3'UTR 的去甲基化，導致NANOG mRNA 穩定性增加。這些數據表明circ_0072083可以通過調節ALKBH5介導的去甲基化來調節NANOG的表達。

circ_0072083 與 miR-1252-5p 相互作用以調節 TMZ 抗性神經膠質瘤細胞中的 ALKBH5/NANOG 軸和 TMZ 抗性

為了分析circ_0072083如何調節ALKBH5/NANOG軸，探索了潛在的 miRNA作為串擾。基于Circinteractome和starBase的數據庫，維恩圖顯示只有一種miRNA（miR-1252-5p）可以與circ_0072083、ALKBH5和NANOG結合。 miR-1252-5p 表達在 TMZ 抗性組織和細胞中顯著降低。為了驗證它們的相互作用，構建了野生型和突變型熒光素酶報告載體。miR-1252-5p 過表達明顯降低了野生型組（WT-circ_0072083、WT-NANOG 3'UTR 和 WT-ALKBH5 3'UTR）的熒光素酶活性，而沒有改變突變組（MUT -circ_0072083，MUT-NANOG 3'UTR 和 MUT-ALKBH5 3'UTR）。此外，Ago2 RIP 分析表明 miR-1252-5p、circ_0072083、ALKBH5 和 NANOG 可以在同一復合物上富集。此外，在U251/TR和U87/TR 細胞中，通過circ_0072083 沉默，miR-1252-5p 水平明顯增強。miR-1252-5p 過表達顯著降低了 U251/TR 和 U87/TR 細胞中的 ALKBH5 和 NANOG 水平。此外，在用 sh-NC + anti-NC、sh-circ_0072083 + anti-NC 或 sh-circ_0072083 + anti-miR-1252-轉染的細胞中研究了 circ_0072083/miR-1252-5p 軸對 ALKBH5 和 NANOG 水平的影響。ALKBH5和NANOG 水平通過circ_0072083沉默顯著降低，這通過miR-1252-5p 敲低恢復。此外，miR-1252-5p 敲低逆轉了 circ_0072083沉默介導的 TMZ IC50 降低、細胞增殖、遷移和侵襲以及促進 U251/TR 和 U87/TR 細胞凋亡。這些結果表明 circ_0072083 可以調節 miR-1252-5p/ALKBH5/NANOG 軸以控制膠質瘤細胞中的 TMZ 抗性。

外泌體circ_0072083的分泌依賴于TMZ抗性神經膠質瘤細胞中的Warburg效應

為了探索circ_0072083是否通過外泌體攜帶，從TMZ抗性和敏感細胞的培養基中分離外泌體。外泌體通過TEM 確認。大小主要在 100-200 nm，抗性細胞比敏感細胞具有更高濃度的外泌體。外泌體還通過特定標記物（CD63、CD81 和 TSG101）鑒定。此外，與 U251 和 U87 細胞相比，U251/TR 和 U87/TR 細胞中的外泌體 circ_0072083 水平明顯升高。此外，在抗性細胞中發現了比敏感細胞更高的 Warburg 效應，這通過乳酸產生、葡萄糖攝取和關鍵酶（GLUT1、LDHA 和 PKM2）水平的增加來揭示。此外，抑制Warburg 效應（紫草素）顯著降低了外泌體濃度和外泌體 circ_0072083 水平，但促進 Warburg 效應（TNF-α）起到了相反的作用。此外，外泌體濃度與葡萄糖濃度和 Warburg 效應水平呈正相關。先前的報告表明，表皮生長因子 (EGF) 和齊墩果酸 (OA) 可以增強或抑制外泌體分泌。在這里，發現了EGF和OA促進或抑制U251 / TR和U87 / TR細胞Warburg效應。此外，EGF 介導的外泌體分泌促進通過抑制 Warburg 效應（紫草素）而減輕；和 OA 介導的外泌體分泌抑制通過促進 Warburg 效應（TNF-α）被逆轉。這些數據表明，在 TMZ 抗性神經膠質瘤細胞中外泌體 circ_0072083 的釋放取決于 Warburg 效應。

來自抗性細胞的外泌體circ_0072083促進敏感神經膠質瘤細胞的TMZ抗性

為了研究外泌體circ_007208對TMZ抗性的作用，從U251/TR和U87/TR細胞敲低circRNA中分離外泌體，并與 U251 和 U87 細胞一起孵育。外泌體circ_0072083水平在轉染sh-circ的U251/TR和U87/TR細胞培養基中明顯降低。與PBS組相比，U251/TR-sh-NC EXO和U87/TR-sh-NC EXO孵育后U251和U87細胞中circ_0072083、ALKBH5和NANOG水平顯著升高，miR-1252-5p表達降低，而這些事件通過 U251/TR-sh-circ_0072083 EXO 和 U87/TR-sh-circ_0072083 EXO 處理的細胞中的 circ_0072083 下調而減弱。此外，U251/TR-sh-NC EXO 和 U87/TR-sh-NC EXO 的孵育顯著增強了 U251 和 U87 細胞中 TMZ 的 IC50，這通過 circ_0072083 敲低而減弱。此外，U251/TR-sh-NC EXO 和 U87/TR-sh-NC EXO 的引入在TMZ (50 μg/mL) 處理下明顯促進細胞增殖、遷移和侵襲并抑制U251和U87細胞的凋亡，但這些U251/TR-sh-circ_0072083 EXO 和 U87/TR-sh-circ_0072083 EXO 組中的 circ_0072083 沉默緩解了事件。

通過U251細胞異種移植模型研究了外泌體circ_0072083對體內神經膠質瘤細胞生長的影響。通過 PBS + TMZ (20 mg/kg)、U251/TR-sh-NC EXO (10 μg) + TMZ (20 mg/kg) 或 U251/TR-sh-circ_0072083 EXO (10 μg) 處理異種移植小鼠+ TMZ（20 mg/kg）。通過添加 U251/TR-sh-NC EXO 顯著增加了腫瘤體積和重量，而通過引入 U251/TR-sh-circ_0072083 EXO 可以減輕這種情況。此外，U251/TR-sh-NC EXO+TMZ組腫瘤組織中circ_0072083、ALKBH5和NANOG的豐度明顯增加，miR-1252-5p表達降低，而這些事件在U251/TR-sh中逆轉-circ_0072083 EXO + TMZ 組。這些結果表明外泌體 circ_0072083 增加了敏感細胞中的 TMZ 抗性。

外泌體circ_0072083與膠質瘤患者的TMZ耐藥、診斷和生存有關

為了分析外泌體 circ_0072083 在膠質瘤患者中的價值，從患者的血清樣本中分離外泌體。通過 TEM 和特定標記物（CD63、CD81 和 TSG101）驗證外泌體。此外，大小主要在100-200 nm，并且在耐藥患者中其濃度更高。此外，與TMZ敏感患者（n ?=33）相比，TMZ耐藥患者（n =36）的外泌體circ_0072083水平顯著上調。此外，通過將這些外泌體暴露于不同條件來評估外泌體 circ_0072083 的穩定性，結果表明 TMZ 耐藥患者中外泌體 circ_0072083 的豐度不受不同孵育時間和不同 pH 值的顯著影響。此外，外泌體 circ_0072083 可以作為神經膠質瘤的獨立診斷靶標（AUC= 0.85，P ?< 0.05），并且外泌體 circ_0072083 水平高的患者總生存率較低（P ?< 0.05）。?根據平均水平將患者分為高（n ?= 36）或低（n = 33）外泌體circ_0072083組。桌子表格11總結出高外泌體circ_0072083水平與膠質瘤患者的腫瘤大小、晚期WHO分級、MGMT甲基化和TMZ抗性相關。這些發現表明外泌體circ_0072083在神經膠質瘤患者中具有重要作用。這表明外泌體circ_0072083可以通過在Warburg效應下調節ALKBH5介導的去甲基化來調節miR-1252-5p/NANOG軸來增加膠質瘤中的TMZ抗性。