外泌體已經成為細胞間通訊的重要媒介。缺氧被廣泛認為是腫瘤侵襲性的關鍵調節因子，并顯著影響腫瘤細胞的外泌體釋放。然而，人們對來自低氧肺腺癌(LUAD)細胞的外泌體的作用知之甚少。2021年6月發表于Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF=11.161）的文章“Hypoxic tumor-derived exosomal miR-31-5p promotes lung adenocarcinoma metastasis by negatively regulating SATB2-reversed EMT and activating MEK/ERK signaling”對此展開了研究。我們發現低氧LUAD細胞來源的外泌體（HExo）能顯著增強常氧LUAD細胞的遷移和侵襲。MiRNA測序結果顯示miR-31-5p在HExo內大量內化，可被常氧LUAD細胞攝取。研究發現，外泌體miR-31-5p可直接靶向SATB2誘導的上皮間質轉化，并顯著增加MEK/ERK信號的激活，從而促進體外和體內腫瘤進展。此外，在LUAD患者，特別是轉移性疾病患者中檢測到較高水平的循環外泌體miR-31-5p。我們的研究結果表明，外泌體miR-31-5p在LUAD進展中發揮了關鍵作用，可以作為LUAD的診斷生物標志物。

技術路線

結果：

1）來自LUAD細胞條件培養基的外泌體的鑒定

將LUAD細胞在缺氧(1% O2)或常氧(20% O2)條件下培養48小時。我們發現缺氧條件下HIF-1α的表達水平顯著升高(圖1a)，這表明我們已經成功建立了一個供后續實驗使用的缺氧模型。然后，用超離心法從LUAD條件培養基中分離外泌體。透射電鏡觀察純化后的外泌體形態，具有典型的外泌體形態，粒徑分布為50-150 nm(圖1b)。NTA數據進一步證實，大多數顆粒直徑約為100 nm(圖1c)，缺氧條件下釋放的外泌體濃度遠高于常氧條件下釋放的外泌體濃度(圖1d)。此外，我們試圖通過western blot驗證純化的外泌體上是否存在外泌體標記物，結果顯示CD63、TSG101和Flotillin在外泌體中高表達 (圖1e)。這些結果表明，我們能夠分離純化的外泌體，缺氧促進外泌體的分泌。

2）HExo增強了常氧細胞的遷移和侵襲能力

為了探究HExo對LUAD細胞的生物學作用，我們用HExo處理A549和H1299細胞，觀察其表型變化。用熒光PKH67標記HExo，這將使我們能夠通過熒光顯微鏡檢測到它們被LUAD細胞內化(圖2a)。我們檢測了EMT相關標記物的變化，發現HExo顯著降低了E-cadherin的表達，而增加了Vimentin的表達(圖2b)。與NExo和PBS對照組相比，劃痕試驗顯示，經HExo處理的腫瘤細胞顯著減少了開放空間(圖2c)。相似的是，在transwell實驗中，HExo處理促進了LUAD細胞的遷移(圖2d)。除了遷移實驗結果外，與HExo共培養的LUAD細胞顯示出顯著增加的侵襲能力(圖2e)。這些數據表明，HExo可促進體外常氧細胞的遷移和侵襲。

3）HExo介導的miR-31-5p向常氧細胞的轉移

先前的一項研究證實，含有miRNA的外泌體可以轉移到受體細胞并影響細胞功能。為了研究這種轉移是否會發生在LUAD細胞中，我們提取HExo和NExo的總RNA，使用Illumina HiSeq平臺進行miRNA-seq分析。我們發現miR-31-5p表達水平最高，并且在LUAD細胞系中穩定上調(圖3a)。因此我們選擇miR-31-5p進行進一步研究。為了確認miR-31-5p是否被外泌體包裹，我們添加了可以降解游離RNA的RNase A和增加細胞膜通透性的Triton X-100。不出所料，RNase A處理組的miR-31-5p表達水平與對照組一致。然而，在RNase A和Triton X-100組中，miR-31-5p水平均顯著降低(圖3b)。這些結果表明，miR-31-5p通過LUAD細胞來源的外泌體傳遞到其他細胞，并通過被雙層脂質雙層膜包裹而免受降解。此外，我們還發現，缺氧條件下，miR-31-5p在HExo中的表達水平高于在NExo中的表達水平，但這些水平在GW4869處理下被逆轉(圖3c)，這進一步表明缺氧條件促進了外泌體的分泌和miR-31-5p向受體細胞的運輸。

4）外泌體miR-31-5p直接靶向SATB2促進LUAD細胞遷移和侵襲

為了確定miR-31-5p可能的細胞靶點，我們使用三個在線數據庫:Targetscan、miRTarbase和miRDB進行重疊分析。分析表明SATB2是miR-31-5p的靶點。接下來，進行熒光素酶測定以驗證數據庫分析的預測準確性。我們發現轉染了miR-31-5p模擬物的A549細胞的熒光素酶活性與NC組的熒光素酶活性相比顯著降低(圖4a)。此外，在HExo治療組中也觀察到類似的結果(圖4b)。此外，在常氧或缺氧條件下轉染miR-31-5p模擬物的細胞顯示SATB2表達水平顯著降低(圖4c)，而使用HExo處理也降低SATB2表達(圖4d)。因此，我們證實SATB2是miR-31-5p的直接靶點。接下來，我們用si-SATB2和/或miR-31-5p抑制劑處理LUAD細胞，以評估外泌體miR31-5p是否可能通過靶向SATB2促進更具侵襲性的表型。與對照組相比，miR-31-5p抑制劑組在愈合試驗和Transwell侵襲試驗中表現出強烈的活性水平下降，而si-SATB2-2處理組在這些試驗中表現出相反的趨勢。然而，在A549和H1299細胞系中，si-SATB2-2組細胞的遷移和侵襲能力可以通過miR31-5p抑制劑的作用而減弱(圖4e-f)。

5）外泌體miR-31-5p促進體內轉移

我們假設來自HExo的外泌體miR-31-5p可以增加異種移植模型中LUAD細胞的轉移能力。在靜脈尾注射后的8周觀察期內，我們取小鼠肺組織標本，用HE染色(圖5a)。通過統計染色組織中轉移性結節的數量，我們發現HExo組小鼠肺轉移性結節比PBS組小鼠肺轉移性結節多，轉染miR-31-5p抑制劑可以消除這種作用。相反，與miR-31-5p抑制劑組相比，HExo聯合miR-31-5p抑制劑治療增加了轉移結節的數量(圖5b)。我們還評估了接受不同外泌體治療的小鼠的總體生存時間。令人驚訝的是，HExo組的小鼠總生存時間比其他三組的小鼠短(圖5c)。此外，我們采用免疫化學方法檢測肺組織中EMT相關標志物和SATB2的表達。在HExo組中檢測到Vimentin表達水平升高，E-cadherin和SATB2表達水平下降，這些表達變化被miR-31-5p抑制劑減弱(圖5d)。

6）miR-31-5p抑制劑可逆轉MEK/ERK信號通路中HExo誘導的進展

MEK/ERK信號通路已被證明參與了侵襲性肺癌表型的發展和EMT過程。因此，為了研究來自HExo的外泌體miR-31-5p對MEK/ERK信號通路的影響，我們評估了MEK和ERK的磷酸化水平。如圖6a所示，與NExo和PBS組相比，HExo組MEK和ERK的磷酸化水平明顯增強。然而，轉染miR-31-5p抑制劑可消除MEK/ERK信號活性升高和EMT的影響，而同時加入HExo和miR-31-5p抑制劑可逆轉這些影響(圖6b)。我們也觀察到外泌體miR-31-5p在功能實驗中發揮類似的作用。轉染miR-31-5p抑制劑可抑制LUAD細胞的遷移和侵襲能力，而轉染HExo和miR-31-5p抑制劑可逆轉這些能力(圖6c-d)。這些結果證實了來自HExo的外泌體miR-31-5p可以增強EMT過程和MEK/ERK信號通路活性。

7）循環外泌體miR-31-5p可能是LUAD的診斷生物標志物

為了探討循環外泌體miR-31-5p是否可能對LUAD具有診斷價值，我們收集了82例LUAD患者和39例健康人的血漿樣本，然后分離出外泌體。透射電鏡照片顯示，樣本含有完整的膜狀顆粒(圖7a)。接下來，我們從血漿來源的外泌體中提取miRNA，發現LUAD患者的外泌體中miR-31-5p水平顯著高于健康對照組的外泌體(圖7b)。此外，我們發現所有轉移性疾病患者LUAD血漿來源的外泌體樣本中外泌體miR-31-5p的水平遠高于非轉移性疾病患者的水平(圖7c)。外泌體miR-31-5p的ROC分析顯示，外泌體miR-31-5p在LUAD患者和健康個體之間具有較高的鑒別能力(圖7d)。以上數據提示外泌體miR-315p可作為LUAD的診斷生物標志物。

結論： miR-31-5p在低氧LUAD細胞衍生的外泌體中大量富集。外泌體miR-31-5p通過降低SATB2表達和增加MEK/ERK通路的活性在癌癥進展中發揮關鍵作用。外泌體miR-31-5p可能作為LUAD的循環診斷生物標志物。