鐵死亡（Ferroptosis）是一種不依賴caspase的調(diào)控細(xì)胞壞死形式，其特征是在細(xì)胞膜上產(chǎn)生鐵依賴的脂質(zhì)過(guò)氧化物。Ferroptosis發(fā)生的一個(gè)基本步驟是破壞質(zhì)膜。然而，導(dǎo)致Ferroptosis質(zhì)膜完整性喪失的分子機(jī)制以及膜損傷的性質(zhì)和大小尚未得到深入研究。其他形式的細(xì)胞死亡如壞死、焦亡或毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡會(huì)導(dǎo)致離子通量的激活。在這些情況下，Ca²⁺通量與膜修復(fù)機(jī)制的激活有關(guān)，同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)體(ESCRT)發(fā)揮了關(guān)鍵的平衡作用，可以延緩壞死和焦亡癥中的細(xì)胞死亡。目前有作者研究了不同細(xì)胞模型中Erastin-1和RSL3引發(fā)的Ferroptosis中質(zhì)膜滲透的分子機(jī)制。利用活細(xì)胞成像和流式細(xì)胞術(shù)，跟蹤了Ferroptosis不同特征的動(dòng)力學(xué)。該研究發(fā)表于2021年3月《Cell Death & Differentiation》期刊上，IF:10.717。

技術(shù)路線：

主要結(jié)果如下：

1. 細(xì)胞內(nèi)Ca2+持續(xù)增加是ferroptosis的標(biāo)志

胞漿Ca²⁺增加、細(xì)胞腫脹以及質(zhì)膜破裂被認(rèn)為是壞死和焦亡的標(biāo)志。為了評(píng)估這些細(xì)胞改變是否也發(fā)生在ferroptosis期間，作者通過(guò)活細(xì)胞共聚焦成像(圖1A-B)和流式細(xì)胞術(shù)(圖1C-H)檢測(cè)了用Erastin-1或RSL3處理的小鼠成纖維細(xì)胞(NIH-3T3)的胞漿Ca²⁺水平，同時(shí)檢測(cè)了細(xì)胞形態(tài)和質(zhì)膜破裂的變化。作者使用fluo-4am作為Ca²⁺指示劑的熒光形式，以可視化細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺水平，并使用熒光DNA插入劑PI作為不可逆質(zhì)膜破壞和細(xì)胞死亡的標(biāo)記。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在使用Erastin-1或RSL3處理后，NIH-3T3細(xì)胞胞質(zhì)Ca²⁺濃度明顯增加(圖1A, B)。胞漿內(nèi)Ca²⁺增加、細(xì)胞圓化和質(zhì)膜破裂可被ferroptosis特異性抑制劑ferrostatin-1（fer1）抑制(圖1A-F)。

圖1 Ferroptosis伴隨著細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺增加和細(xì)胞死亡

2. 脂質(zhì)氧化先于胞質(zhì)Ca2+的增加和質(zhì)膜的破壞

體積細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中Ferroptosis特征之間的詳細(xì)時(shí)間關(guān)系被治療后群體細(xì)胞發(fā)生Ferroptosis的異質(zhì)性所掩蓋。為了解決這個(gè)問(wèn)題，作者使用活細(xì)胞共聚焦顯微鏡在單細(xì)胞水平上量化了Fluo-4 AM信號(hào)、細(xì)胞圓度和PI攝入量的增加。從單個(gè)細(xì)胞獲得的動(dòng)力學(xué)曲線(圖2C, F, K)中，計(jì)算出每個(gè)ferroptotic表型(t50)實(shí)現(xiàn)50%變化所需的時(shí)間，這使得可以設(shè)置Ferroptosis各過(guò)程之間的滯后時(shí)間(圖2D, G, L)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與所使用的Ferroptosis觸發(fā)器無(wú)關(guān)，胞漿Ca²⁺的增加先于細(xì)胞圓縮和質(zhì)膜完全坍塌(圖2A, B)。從流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)(圖1G)可以看出，Erastin-1存在時(shí)，胞質(zhì)Ca²⁺的增加是一個(gè)雙相行為的兩步過(guò)程(圖2C)。第一個(gè)事件在最大Ca²⁺信號(hào)的40%左右達(dá)到飽和，與不相關(guān)的鈣(Ca²⁺_un)增加相對(duì)應(yīng)，因?yàn)樗鼪](méi)有受到Ferroptosis的抑制(圖1G)。第二次Ca²⁺升高，與RSL3處理常見，并被Fer-1抑制，對(duì)應(yīng)的是針對(duì)鐵下垂的胞質(zhì)Ca²⁺增加(Ca²⁺_sp) (圖2F)。在Erastin-1處理后，Ca²⁺_un增加，隨后Ca²⁺_sp上升，細(xì)胞周圍和最終的PI攝入(圖2C-E)。相比之下，RSL3處理的細(xì)胞具有獨(dú)特和特定的Ca²⁺上升，隨后細(xì)胞圓整和最終的PI攝入(圖2F-H)。通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化傳感器C11 BODIPY 581/591觀察到RSL3處理促進(jìn)了質(zhì)膜和亞細(xì)胞膜上的脂質(zhì)過(guò)氧化（圖2I），脂質(zhì)過(guò)氧化先于細(xì)胞圓化(圖2J, K)。考慮到胞質(zhì)Ca²⁺增加到細(xì)胞圓化之間的滯后時(shí)間始終低于脂質(zhì)過(guò)氧化到細(xì)胞圓化之間的滯后時(shí)間，可以估計(jì)Ca²⁺的增加發(fā)生在脂質(zhì)過(guò)氧化之后(圖2M)。這一估計(jì)是基于fluo- 4am(圖2F-H)和BODIPY氧化比(圖2K, L)的獨(dú)立動(dòng)力學(xué)之間的推斷。

圖2 在質(zhì)膜破裂之前，胞質(zhì)Ca²⁺和脂質(zhì)氧化增加

3. 滲透活性劑保護(hù)細(xì)胞防止ferroptosis

氣孔形成是不同類型調(diào)控細(xì)胞死亡的共同特征。質(zhì)膜孔的打開導(dǎo)致水分子的流入，這是由于無(wú)法通過(guò)膜孔的高濃度細(xì)胞內(nèi)大分子造成的滲透失衡的結(jié)果(圖3A)。這種效果可以通過(guò)添加不能夠通過(guò)孔進(jìn)入細(xì)胞的適當(dāng)大小的滲透保護(hù)劑peg來(lái)阻止，從而平衡細(xì)胞內(nèi)滲透壓、水流入和隨后的細(xì)胞坍塌(圖3B)。加入1.8?nm的peg并不能阻止胞質(zhì)Ca²⁺的增加、細(xì)胞圓化或細(xì)胞死亡(圖3C-F)。相比之下，在peg(2.3nm和2.7nm)的存在下，胞質(zhì)Ca²⁺水平的增加和細(xì)胞死亡均以尺寸依賴的方式延遲(圖3D, F)。PEG(2.7nm)對(duì)ferroptosis的保護(hù)作用在洗滌后恢復(fù)，這表明膜損傷隨時(shí)間的推移是穩(wěn)定的(圖3G)。我們還發(fā)現(xiàn)，PEG(2.7nm)并不能阻止RSL3處理的NIH-3T3細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化(圖3H, I)。對(duì)于使用的所有PEG大小，NIH-3T3細(xì)胞處理較長(zhǎng)時(shí)間(24 h)后細(xì)胞死亡恢復(fù)(圖3J)。PEG對(duì)ferroptosis動(dòng)力學(xué)的抑制作用也隨著RSL3濃度的增加而降低(圖3K, L)。最終作者以在較低濃度RSL3下能夠起到保護(hù)作用的PEG尺寸作為參考，得出質(zhì)膜穿孔部分的半徑約為2.5 nm(圖3L)。

圖3 大尺寸的PEG對(duì)ferroptosis有滲透保護(hù)作用

4. ESCRT-III復(fù)合物在ferroptosis期間被激活，并拮抗細(xì)胞死亡

在壞死和焦亡過(guò)程中，依賴于ESCRT-III復(fù)合物作用的膜修復(fù)可以延緩細(xì)胞死亡。作者使用CHMP4B斑點(diǎn)形成作為代替ESCRT-III激活。最初，CHMP4B主要表現(xiàn)為均勻的胞質(zhì)分布，然而，在RSL3處理后，該蛋白定位于不同的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，隨著時(shí)間的推移，其數(shù)量和熒光強(qiáng)度都在增加(圖4A, B)。CHMP4B點(diǎn)的形成大致與胞質(zhì)Ca²⁺濃度的增加相一致(圖4C, E)。當(dāng)細(xì)胞修復(fù)機(jī)制最終被淹沒(méi)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺水平持續(xù)升高、細(xì)胞圓化和ESCRT-III復(fù)合體激活后，細(xì)胞膜最終破裂(圖4B, E, F)。PEG(2.7nm)處理也阻斷了CHMP4B斑點(diǎn)的形成 (圖4G-J)。這些結(jié)果證明了ESCRT-III復(fù)合物以Ca²⁺依賴的方式被激活來(lái)修復(fù)膜損傷。

為了研究ESCRT-III在ferroptosis中的功能作用，作者評(píng)估了抑制CHMP4B對(duì)NIH-3T3細(xì)胞死亡的影響(圖5A, B)。與對(duì)照組相比，CHMP4B敲除細(xì)胞的死亡發(fā)生率更高、更快，特別是在早期時(shí)間點(diǎn)(1-3 h)，這表明CHMP4B的缺失導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)ferroptosis的敏感性更高。另外，作者使用蛋白質(zhì)組譜儀XL細(xì)胞因子陣列試劑盒(圖5C)，確定ferroptosis是否可以直接調(diào)節(jié)不同細(xì)胞系和不同處理下的細(xì)胞因子分泌。在誘導(dǎo)ferroptosis時(shí)，作者檢測(cè)到細(xì)胞因子亞群水平的變化，這些變化與細(xì)胞系和治療有關(guān)。此外，敲除CHMP4B改變了RSL3處理后獲得的細(xì)胞因子譜(圖5C, D)。這些結(jié)果表明，盡管具體的細(xì)胞因子改變依賴于治療，但ESCRT-III通常影響ferroptotic細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌。另外，RSL3處理的沉默CHMP4B細(xì)胞的上清能夠增加小鼠巨噬細(xì)胞的CD14表面表達(dá)(圖5E)。這些結(jié)果表明，與壞死和焦亡相似，ESCRT-III也調(diào)節(jié)ferroptotic細(xì)胞的免疫輸出。

圖4 膜損傷與CHMP4B活化有關(guān)

圖5 ESCRT-III調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡和嗜鐵細(xì)胞的免疫結(jié)果

結(jié)論：

ESCRT-III在ferroptosis微環(huán)境中調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平，揭示了這一機(jī)制在調(diào)控ferroptosis炎癥的作用。這些發(fā)現(xiàn)支持了一個(gè)普遍的模型，在這個(gè)模型中，質(zhì)膜孔的形成和膜修復(fù)是控制不同類型的壞死及其炎癥特征的中心和相反的調(diào)控機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

Pedrera L, Espiritu RA, Ros U, Weber J, Schmitt A, Stroh J, Hailfinger S, von Karstedt S, García-Sáez AJ. Ferroptotic pores induce Ca²⁺ fluxes and ESCRT-III activation to modulate cell death kinetics. Cell Death Differ. 2021, 28(5):1644-1657. doi: 10.1038/s41418-020-00691-x