2021年6月，最新一篇發表在Nat Immunol.（IF=25.600）的文章（Mitochondrial stress induced by continuous stimulation under hypoxia rapidly drives T cell exhaustion.）當腫瘤內衰竭T細胞經歷嚴重缺氧時，他們假設代謝應激會改變其對其他信號的反應，特別是持續的抗原刺激。在體外，盡管單獨經歷連續刺激或缺氧的CD8 + T細胞分化為功能性效應物，但這種組合迅速驅動了與衰竭一致的T細胞功能障礙。連續刺激促進了Blimp-1介導的PGC-1α依賴性線粒體重編程阻遏作用，使細胞對缺氧的反應較差。線粒體功能的喪失產生了無法耐受的活性氧（ROS）水平，足以促進衰竭狀態，部分原因是通過磷酸酶抑制和隨后活化T細胞核因子的活性。減少T細胞固有的ROS和降低腫瘤缺氧限制了T細胞衰竭，與免疫療法協同作用。因此，免疫信號和代謝信號之間存在內在聯系：通過減輕代謝壓力，可以改變T細胞分化，從而促進更多的功能性細胞命運。

背景：T細胞分化是一個復雜的過程，它整合了來自環境的大量信號，參與轉錄機制，并進行表觀遺傳改變來支持新的功能程序。對于CD8+ T細胞，這導致獲得不同的命運:短命的細胞毒性效應程序和長壽命的自我更新記憶程序。然而，在抗原持續存在的病理中，特別是慢性感染和癌癥中，會誘導一種替代效應或記憶分化的命運:T細胞衰竭。在持續的炎癥提示下，T細胞逐漸失去多功能和更新能力，無法控制感染或惡性擴散。T細胞逐步上調共抑制分子，最終達到最終分化狀態，表達高水平的PD-1和多種共抑制和共刺激標志物(lag3, Tim-3, TIGIT，和4 1BB)。衰竭的細胞由幾種轉錄因子網絡定義，包括Eomesodermin、BATF、無伴侶NFAT1、TOX和轉錄抑制因子Blimp-1，利用改變的表觀遺傳環境定義功能失調譜系。衰竭有一個不斷演變的定義，而且只能在體內可靠地產生，這嚴重限制了識別這種命運的驅動因素的能力。

分化通常與T細胞接收的免疫信號有關:共刺激或細胞因子信號支持一種或另一種命運。然而，環境的代謝組成、檢測該環境的營養傳感器以及T細胞固有的代謝狀態也對決定分化的最終結果至關重要。代謝信號是理解的關鍵，因為T細胞的激活和分化發生在各種代謝不同的組織環境。在癌癥中，腫瘤細胞代謝的升高可以顯著改變T細胞所經歷的營養環境。我們之前的研究表明，T細胞浸潤腫瘤時存在嚴重的代謝缺陷:葡萄糖攝取能力受到抑制，功能性線粒體質量喪失，伴隨衰竭的發展。我們和其他人也表明，糾正這種錯誤的代謝狀態(通過各種方法)可以增強免疫功能，實現免疫治療效果。

例如，雖然之前認為抗PD-1可以阻斷最末期枯竭的T細胞上的PD-1信號，但這種直接模型已經受到質疑，表明PD-1成功阻斷可能作用于分化較低的類祖細胞，高比例的腫瘤浸潤最終耗盡的T細胞預測抗pd -1的耐藥。此外，雖然代謝相關因素，如腫瘤細胞消耗氧氣和產生缺氧的能力，可以預測對PD-1阻斷劑的抗性18，但這些環境壓力源已被證明對T細胞功能有不同的影響。缺氧誘導因子1α (HIF1α)及其負調控因子此前已被證實與T細胞激活有關23，而在缺氧條件下治療細胞的擴張可增強腫瘤殺傷能力。然而，無論是在隔離狀態還是在體內，缺氧都具有明顯的免疫抑制作用。因此，雖然代謝壓力和T細胞衰竭有聯系，但尚不清楚T細胞衰竭是否促進了導致細胞代謝改變的程序，或者是否代謝不足和壓力直接導致了T細胞衰竭。

技術路線：

一、耗盡的腫瘤內T細胞會經歷嚴重的缺氧

雖然缺氧在腫瘤中很常見，但尚不清楚腫瘤內T細胞亞群是否比其他T細胞更容易缺氧。我們首先在8-10 mm(第14天)B16黑色素瘤中沿著衰竭譜對CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)進行表型分析(擴展數據圖1a)。最終衰竭的T細胞被定義為高水平和持續表達PD-1和共表達Tim-3(圖1a)，具有高的LAG3和Tox表達，低的TCF1表達，通過將gp100特異的Pmel-1 T細胞轉移到攜帶b16的小鼠中，一旦它們達到最終衰竭，就會重新刺激它們，從而測定抗原特異性反應(擴展數據圖1b)。與LN-resident Pmel-1 T細胞相比，gp100-restimulated T細胞的多功能性要少得多(圖1f)。在處死B16腫瘤小鼠之前，將其注入一種缺氧示蹤劑吡莫硝唑，使用抗吡莫硝唑和抗hif1 α抗體，發現與其他亞群相比，最終耗盡的T細胞缺氧程度最高(圖1g,h)。因此，缺氧是腫瘤代謝景觀的主要代謝組成部分，與其他亞群相比，最終衰竭的T細胞會經歷更高的缺氧。

二、在缺氧條件下持續刺激的T細胞出現衰竭

為了確定缺氧是否會導致細胞衰竭，在體外建立暴露于缺氧應激的模型。a，體外CD8+ T細胞d10的TNF和IFN-γ的產生，在缺氧或缺氧條件下，用抗cd3 /CD28珠急性或持續激活d2- 5，然后在常氧或缺氧條件下額外培養5天。b，，圖2中使用的刺激方案生成的第3天CD8+ T細胞CTV稀釋液的代表性直方圖和division分析。c, CD8+ T細胞的擴增(左)和累積倍增(右)。d，第3天或第4天產生的CD8+ T細胞的染色稀釋(增殖)與細胞死亡(活/死)染色。e, PD-1在cd4 + T細胞中的平均熒光強度。.f–h。第3天CD8+ T細胞的流式圖。

三、在缺氧條件下的持續激活誘導不同的細胞內程序

已知的缺氧信號靶點BNIP3在缺氧下升高，mTORC1在持續刺激下被激活(圖3a)。從這四種條件中獲得的RNA序列被用來比較培養物和之前公布的數據之間的轉錄組。主成分分析顯示，所有四個群體的轉錄組都不同(圖3b)。缺氧條件下的持續刺激并沒有誘導持續刺激和缺氧誘導基因的組合，而是驅動了一個不同的轉錄譜(圖3c）。基因本體論表明，連續刺激條件之間共享的基因簇與負調控和代謝變化相關(簇3和簇5)(圖3b)。與缺氧條件下持續刺激相關的基因(聚類1和7)主要由抗病毒和抗增殖基因驅動。

四、Blimp-1在持續刺激下抑制PGC1α

持久抗原對于改變向衰竭分化至關重要，但其代謝后果尚不清楚。由于連續的刺激不產生明顯的代謝抑制，持續的刺激可能激活一個轉錄抑制因子，阻止代謝重編程。Blimp-1(由Prdm1編碼)就是這樣一種抑制因子，在B16黑色素瘤中最終耗盡的CD8+ T細胞中高度上調(圖4a)，并在缺氧條件下持續激活(圖4b)。體外缺氧條件下持續激活的T細胞也抑制PGC1α的表達(圖4c)。 進一步確定Blimp-1是否可以抑制PGC1α，發現強制表達Blimp-1可以抑制293T細胞中Ppargc1a啟動子構建的活性，而不影響其活力(圖4d)。Prdm1f/fCd4Cre小鼠的CD8+ T細胞通過在缺氧條件下持續激活而抵抗功能障礙(圖4e,f)，而在持續激活條件下無法抑制Ppargc1a的表達(圖4g)。在PD-1hiTim3+ TILs中，Blimp-1的缺失導致了通過IL-2和腫瘤壞死因子(TNF)產生的線粒體質量和多功能性的恢復(圖4h, i)。

五、ROS通過作為磷酸酶抑制劑來驅動衰竭

腫瘤浸潤PGC1α oe Pmel-1 T細胞在腫瘤浸潤時線粒體ROS減少(圖5a)，表明PGC1α部分作用于腫瘤浸潤時ROS的減少。 內源性B16 TIL檢查顯示，最終耗盡的T細胞含有大量的mtROS(圖5b)。體外缺氧條件下的持續激活也產生了高水平的mtROS(圖5c)，表明ROS可能是T細胞衰竭的驅動因素(圖5d,e)。低、無毒劑量的藥物用于培養T細胞數天，激活T細胞(24小時)，然后在抗霉素A存在的情況下擴增，會導致衰竭樣功能障礙:共同抑制分子高表達，多功能性減少(干擾素-g (IFN-γ)和TNF的產生)(圖)。5 f, g)。添加魚藤酮，當添加到抗霉素A處理時，整個電子傳遞鏈崩潰，挽救了功能障礙，表明所觀察到的衰竭不是由于線粒體功能的喪失，而是由于線粒體應激和隨后的ROS(圖5d-g)。為了進一步解決ROS驅動功能障礙的作用，我們使用n -乙酰半胱氨酸(NAC)，一種中和ROS的細胞滲透性抗氧化劑(圖5h)。NAC能夠防止抗霉素A或缺氧下持續刺激引起的功能障礙(圖5i m)。

ROS及其細胞副產物是酪氨酸磷酸酶的有效抑制劑，、用抗霉素A培養T細胞可導致酪氨酸磷酸化的持續和升高(圖6a)，這被魚藤酮或NAC阻斷(圖6a,b)。免疫印跡分析顯示，在aa誘導的ROS下，酪氨酸磷酸化的絕對數量增加，但幾種不同的蛋白在NAC處理下有差異的磷酸化(圖6b)。TCR-reporter Nur77-GFP小鼠研究表明在TCR信號缺失的情況下，抗霉素A誘導GFP表達;在低于連續刺激條件下誘導的信號時，抗霉素A處理產生的GFP與酪氨酸磷酸酶抑制劑orthovandate (50 μm)培養的T細胞表型相匹配(圖6c)。磷酸酪氨酸級聯促進NFAT1的核積累，單獨的ROS誘導(通過抗霉素A)以魚藤酮抑制的方式促進NFAT1核的增加(圖d).

六、減輕ROS或缺氧可緩解T細胞衰竭

Pmel-1 T細胞被轉導Gpx1, Gpx1是一種谷胱甘肽過氧化物酶和已知的能作用于許多ROS物種的PGC1α靶點，然后轉移到攜帶b16的動物體內。與pgc1 α轉導的細胞一樣，gpx1過表達的T細胞對腫瘤中ROS的積累具有抗性(圖7a)。過表達gpx1的TIL T細胞保持功能，產生更多的ifn - γ(圖7b)。因此，通過細胞固有的方式減少ROS可以保護T細胞免受腫瘤誘導的衰竭。Ndufs4缺乏的腫瘤在體外沒有明顯的氧消耗，在體內產生較少的缺氧(圖7c,d)。在這些內源性的浸潤性CD8+ T細胞中，較小比例的細胞發展到最終衰竭(圖7e)。然而，雖然這些細胞仍然表達多種共抑制分子，但浸潤Ndufs4缺陷腫瘤的PD-1hiTim3+ T細胞顯示多功能性增加(圖7f)。用低劑量(10 mg/kg)阿西替尼治療b16小鼠降低了腫瘤總量和用吡莫唑測量的T細胞缺氧(圖7g,h)。瘤內T細胞表型上耗竭較少(圖7i)，多功能性較多(圖7j)，提示通過靶向VEGFR和降低缺氧，T細胞可能對免疫治療更敏感。在體內用低劑量阿西替尼治療荷瘤小鼠可使荷瘤小鼠對CTLA-4和PD-1阻斷劑致敏，降低腫瘤負擔并提高生存率(圖7k)。通過靶向腫瘤微環境的缺氧特性，T細胞不會分化到終末衰竭，并保持對檢查點封鎖的反應。