m⁶A RNA甲基化是mRNA轉錄后最常見的內部甲基化。這是一個由m⁶A WER系統控制的可逆過程，由書寫器(W)、擦除器(E)和閱讀器(R)組成，而m⁶A甲基化的最終結果取決于特異性閱讀器的識別并結合。目前研究發現抑制肺腺癌(LUAD)與m6A閱讀器YTHDC2相關。該研究2021年1月發表在《Redox biology》，IF：11.799的期刊上。

技術路線：

主要結果如下：

1. YTHDC2表達在LUAD中被抑制，且與臨床預后差相關

為了驗證m⁶A閱讀器在肺癌的表達，作者通過GEPIA數據庫分析了LUAD中已知的閱讀器，包括YTHDF1/2/3、YTHDC1/2、HNRNPA2B1、HNRNPC/G、eIF3A、FMR1和IGF2BP1/2。如圖1A和B顯示，與正常肺相比，LUAD 中YTHDC2、IGF2BP2表達下調，而結合Oncomine數據庫和Kaplan-Meier圖譜進一步分析，發現較低的YTHDC2與LUAD患者較差的總生存率相關(圖1D)，這證實了YTHDC2與LUAD存在負相關的關系。

接著作者為了進一步證明YTHDC2與LUAD的關系，與相鄰的癌旁組織相比，在LUAD腫瘤中觀察到YTHDC2 mRNA和蛋白的顯著下調(圖1E-G)，組織芯片檢測(TMA)評估cohort #1中YTHDC2的表達，結果顯示51% (98/192) LUAD患者的YTHDC2表達下調(圖1H、I)。值得注意的是，YTHDC2表達下調與更大的腫瘤直徑和更晚期的分期相關(圖1J、K)。表明抑制YTHDC2可促進LUAD的腫瘤進展。

圖1 YTHDC2表達在LUAD中被抑制，且與臨床預后差相關

2. 過表達YTHDC2抑制細胞活力和腫瘤發生

為了探索YTHDC2在體內的m⁶A解讀器功能，作者構建AAV5表達系統(KPY^WT、KPY^ΔYTH和對照KPE)(圖2A)。與KPE小鼠感染25周后的腫瘤相比，KPY^WT和KPY^ΔYTH小鼠的腫瘤證實了YTHDC2持續上調(圖2B)，這表明AAV5表達系統具有持久的效率。雖然YTHDC2不能阻止腫瘤的發生，但腫瘤發生時間延遲，腫瘤負荷明顯受到抑制，KPY^WT小鼠的生存時間比KPE小鼠和KPY^ΔYTH小鼠更長(圖2C-F)。

作者進一步研究YTHDC2是否是存在人類LUAD細胞中的一種腫瘤抑制因子。IB檢測證實了YTHDC2的過表達和敲除效率(圖2G和S2A)。然而在H1299細胞中過表達YTHDC2^WT后，腫瘤3D球體的數量和大小以及異種移植瘤的生長下降，但在過表達YTHDC2^ΔYTH時沒有觀察到這些現象(圖2 H-K)。相比之下，敲除H1975細胞中的YTHDC2增加了小鼠的球體形成和異種移植瘤的生長(圖S2B-E)。值得注意的是，當使用YTHDC2^{sg2?resistant (res)}重組YTHDC2表達時，YTHDC2^sg2在腫瘤發生中的陽性作用得到了恢復(圖S2B-E)。因此，YTHDC2通過其m6A閱讀域在LUAD中發揮腫瘤抑制功能。

圖2 過表達YTHDC2抑制細胞活力和腫瘤發生

圖S2    敲除YTHDC2促進細胞活力和腫瘤發生

3. YTHDC2抑制LUAD的胱氨酸攝取和下游抗氧化程序

為了研究YTHDC2對代謝物的影響，作者對YTHDC2低表達和高表達的LUAD標本(分別稱為YTHDC2^low和YTHDC2^high)進行代謝組學分析(n = 20/組)。如圖3A顯示，GSH代謝在KEGG通路中排名前20。在顯著改變的代謝產物中，與YTHDC2^high的腫瘤相比，YTHDC2^low的腫瘤中胱氨酸含量增加了3.975倍(圖3B)。此外，在cohort #1 (n = 100)中，YTHDC2和胞內胱氨酸呈負相關(圖3C)。這些數據表明YTHDC2減少了細胞內的胱氨酸。

L-14c-胱氨酸攝取試驗結果顯示，YTHDC2通過其YTH域抑制了H1299細胞產生的異種移植物、小鼠形成的LUAD和患者來源的LUAD細胞的胱氨酸攝取(圖3D-F)。圖3H證明了系統Xc功能受損與GSH水平降低相關。NAC和GSH給藥后，KPY^WT小鼠的腫瘤負荷明顯高于給藥對照小鼠，且水平與KPE小鼠相似(圖3H、I)。與KPE小鼠相比，GSH和NAC給藥僅導致KPY^WT小鼠腫瘤中GSH/GSSG比值顯著增加。NAC和GSH的補充降低了KPY^WT小鼠的脂質過氧化并縮短了存活時間(圖3K、L)。

圖3 YTHDC2抑制LUAD的胱氨酸攝取和下游抗氧化程序

4. YTHDC2抑制依賴于SLC7A11的胱氨酸攝取

Xc^-系統是一個胱氨酸/谷氨酸逆向轉運蛋白，捕獲細胞外的胱氨酸，用于谷胱甘肽的合成，以交換谷氨酸的釋放。在圖3中，被抑制的Xc^-系統功能與YTHDC2受損的胱氨酸攝取有關，然而YTHDC2如何調節Xc^-系統依然未知。文獻報道催化亞基SLC7A11在維持Xc^-系統活性方面起著重要作用。作者通過IB 和RT-qPCR發現，SLC7A11蛋白和mRNA水平均受YTHDC2負調控(圖4A、B)。在小鼠中，與KPE和KPY^ΔYTH小鼠相比，KPY^WT小鼠的腫瘤中SLC7A11表達下調(圖4C、D)。這證明YTH結構域是YTHDC2抑制SLC7A11表達的前提。

隨后，作者研究了YTHDC2是否通過SLC7A11抑制胱氨酸攝取。當YTHDC2在H1299細胞中過表達時，并過表達SLC7A11完全恢復了受損的胱氨酸攝取(圖4E-G)。ATF4是SLC7A11轉錄的關鍵轉錄因子，ATF4在H1299細胞中上調SLC7A11(圖4H、I)。過表達YTHDC2仍然拮抗ATF4的作用(圖4H-J)。因此，YTHDC2損害依賴于SLC7A11的胱氨酸攝取。結合臨床分析，YTHDC2表達下調，而SLC7A11表達上調(圖4K、L)，并且它們在腫瘤中呈負相關(圖4M)。

圖4 YTHDC2抑制依賴于SLC7A11的胱氨酸攝取

5. YTHDC2以m⁶A依賴的方式使SLC7A11 mRNA不穩定

作者為研究YTHDC2是否在轉錄被阻斷后調控SLC7A11 mRNA的穩定性，通過泛轉錄抑制劑ActD處理H1299和H1975細胞，發現YTH結構域對于YTHDC2縮短H1299細胞中SLC7A11 mRNA的半衰期至關重要(圖5A)。在H1975細胞中，CRISPR/Cas9技術使YTHDC2功能喪失，然后YTHDC2重構，進一步證實YTHDC2加速了SLC7A11 mRNA的衰變(圖5B)。EXOSC10是一種外切酶，負責3’-5’外切酶活性。EXOSC10的缺失，減弱了YTHDC2縮短SLC7A11 mRNA半衰期的作用(圖5C、D)。在藥理學水平上，用兩種泛-RNase抑制劑DEPC和RNasin治療H1299細胞，也阻斷了YTHDC2的功能(圖5D)。

YTHDC2調節SLC7A11 mRNA的穩定性(圖5A-D)，而控制RNA衰減是m⁶A甲基化的重要功能之一。作者先驗證METTL3刺激m⁶A的能力(圖5E、F)。在H1975細胞中敲降METTL3延長了SLC7A11 mRNA的半衰期，而在H1299細胞中過表達METTL3則加速了SLC7A11 mRNA的降解(圖5G)。此外，H1299細胞中降低METTL3表達阻斷了YTHDC2，從而減緩SLC7A11 mRNA的衰減，刺激胱氨酸攝取并減弱脂質活性氧(ROS)的生成(圖5H-J)，這表明YTHDC2在LUAD細胞中的作用是依賴m⁶A。

圖5 YTHDC2以m⁶A依賴的方式使SLC7A11 mRNA不穩定

6. YTHDC2傾向于相互作用并使m⁶A甲基化的SLC7A11 mRNA不穩定

為了揭示SLC7A11 mRNA中潛在的m⁶A甲基化位點，在H1975細胞中METTL3敲除前后分別進行了MeRIP-seq研究。在H1975細胞中，無論是否敲除METTL3, GGAC motif都高度富集于m⁶A位點(圖6A)。m⁶A峰在mRNA停止密碼子附近的3’非翻譯區(3’UTR)尤為豐富(圖6B)。為了進一步證實SLC7A11 mRNA的m⁶A依賴性修飾，我們進行MeRIP-qPCR。在H1975細胞中，敲除METTL3后，SLC7A11 mRNA中的m⁶A修飾明顯減少，特別是在假定的m⁶A位點周圍。相反，當METTL3在H1299細胞中過表達時，觀察到相反的結果(圖6C)。

作者進行了PAR-CLIP實驗，以評估SLC7A11 mRNA-YTHDC2相互作用是否依賴于m⁶A甲基化。結果表明，在H1299細胞中，通過過表達METTL3來提高m⁶A的甲基化水平，促進YTHDC2與SLC7A11 mRNA的結合(圖6D)。無論METTL3是否過表達，YTH結構域的缺失都阻斷了SLC7A11 mRNA-YTHDC2的相互作用(圖6D)。作者通過SLC7A11 3’-UTR探針進行RNA-pull down實驗，發現YTHDC2^WT，優先結合于含有m⁶A的SLC7A11 mRNA的3'UTR，而不是含有未甲基化腺苷的mRNA(圖6E)。此外，YTHDC2傾向于結合m⁶A共識基元GGAC (圖6E)。通過在H1299和H1975細胞中進行METTL3的功能增加和丟失實驗，發現細胞內SLC7A11 mRNA-YTHDC2的相互作用是由m⁶A水平決定的(圖6F和G)。這些數據表明YTHDC2優先與m⁶A甲基化的SLC7A11 mRNA結合。

作者構建了 (WT) SLC7A113’-UTR和突變型(Mut) 3’-UTR兩種質粒(圖6H)。結果表明，只有過表達YTHDC2^WT降低SLC7A11 mRNA在H1299細胞中的穩定性，敲除YTHDC2可以提高SLC7A11 mRNA在H1975細胞中的穩定性。然而，與WT 3’-UTR相比，Mut報告基因的這些作用減弱(圖6I和J)。在檢測外源性F-Luc-SLC7A11融合mRNA的RNA穩定性后，得到了類似的結果(圖6K-M)。總的來說，3’-UTR上的m6A位點對于YTHDC2使SLC7A11 mRNA不穩定至關重要。

圖6 YTHDC2傾向于相互作用并使m⁶A甲基化的SLC7A11 mRNA不穩定

7. 抑制YTHDC2對XC^-系統靶向治療敏感，并與LUAD進展相關

為了評估YTHDC2抑制在LUAD中的重要性，從cohort #1隨機抽取20例YTHDC2^low LUAD，其中50%屬于腺泡型(圖7A)。在cohort #2中，與相鄰組織相比，腫瘤中YTHDC2表達下調，62%(62/100)的腺泡組織被歸類為YTHDC2^low(圖7B、C)。與無這種表達模式的腺泡性LUAD患者相比，YTHDC2^low的患者總生存期要短得多(圖7D)，進一步表明YTHDC2抑制可能對腺泡性LUAD的腫瘤進展尤為重要。另外，相對于癌旁組織，腫瘤中腺泡LUAD組織中SLC7A11 mRNA和蛋白水平表達量都比較高(圖7E、F)。

來自4個不同腺泡性LUAD患者的PDX模型被給予XC^-系統抑制劑erastin (PKE)和多激酶抑制劑索拉非尼(sorafenib)。與DMSO治療的對照組相比，PKE和sorafenib給藥時觀察到顯著的腫瘤消退(圖7G-J)。此外，PKE和sorafenib給藥小鼠也導致腫瘤中MDA和4-HNE的顯著增加(圖7K和L)，提示誘導的脂質過氧化可能是抑制腺泡LUADs腫瘤發生的結果。

圖7M顯示，與癌旁組織相比，癌癥組織中MDA和YTHDC2表達量都降低，而SLC7A11 mRNA和蛋白水平都升高，證明在LUAD中抑制YTHDC2可通過SLC7A11表達上調阻止脂質過氧化。同樣地，MDA和YTHDC2與癌癥期數呈負相關，而SLC7A11與分期呈正相關(圖7N)，說明SLC7A11的升高可能是抑制YTHDC2促進LUAD進展的關鍵。

圖7 抑制YTHDC2對XC^-系統靶向治療敏感，并與LUAD進展相關

結論：

本研究強調了m⁶A閱讀器YTHDC2在LUAD中的重要性。XC^?系統活性可能通過抑制YTHDC2來誘導促進腫瘤發生。此外，基于YTHDC2表達的分子模型可能有助于預測LUAD的預后。抑制劑靶向XC^?系統可能有助于治療預后不良的LUAD患者。因此，本研究對LUAD的腫瘤發生、分子分型和藥物敏感性提供了有價值的見解。

研究模型通路

參考文獻：

Ma, L., Chen, T., Zhang, X., Miao, Y., Tian, X., Yu, K., Xu, X., Niu, Y., Guo, S., Zhang, C., Qiu, S., Qiao, Y., Fang, W., Du, L., Yu, Y., Wang, J. (2021). The m⁶A reader YTHDC2 inhibits lung adenocarcinoma tumorigenesis by suppressing SLC7A11-dependent antioxidant function. Redox Biol., 38:101801. doi:10.1016/j.redox.2020.101801