食道癌是世界上第六大最常見的腫瘤，據報道患者5年生存率只有12-20%。N 6 -甲基腺苷 (m6A) 修飾是真核生物 mRNA 中最豐富的 RNA 修飾，主要由 m 6 A 調節劑介導。m 6 A 修飾調節 RNA 穩定性和翻譯效率、染色質狀態、替代聚腺苷酸化和前體 mRNA 剪接。

今天我們來講一篇刊登在Nature Communications（IF=14.91）上的一篇文章，題名為METTL3 promotes tumour development by decreasing APC expression mediated by APC mRNA N 6-methyladenosine-dependent YTHDF binding。

上調 METTL3 與 ESCC 患者的不良生存相關

為探討食管癌中中METTL3的表達譜，分析了腫瘤基因組圖譜（TCGA）數據，發現與11個相鄰的正常食管上皮組織相比，95個食管癌標本中METTL3的表達顯著上調。對包含81對ESCC標本和鄰近正常食管上皮組織的組織芯片進行IHC染色顯示，ESCC組織中的METTL3表達水平顯著高于配對鄰近正常組織。Kaplan-Meier分析顯示，高表達METTL3的患者總生存時間比低表達METTL3的患者短。9種不同ESCC細胞系中METTL3 mRNA和蛋白質的表達水平高于Het-1a永生化正常食管上皮細胞。這些結果表明，METTL3在食管鱗癌中表達上調，并與食管鱗癌患者生存時間呈負相關。

METTL3促進小鼠ESCC細胞增殖和腫瘤生長

為了確定METTL3在細胞增殖中的作用，通過轉染METTL3 shRNAs來去除ESCC細胞中的METTL3。發現METTL3缺失減少了這些細胞的增殖和集落數。通過在KYSE180和KYSE450中重組表達METTL3，這些抑制作用被消除。

   接下來在KYSE450細胞中建立四環素誘導的METTL3表達。四環素治療以劑量依賴的方式增加METTL3的表達，相應地引起細胞增殖水平的增加和集落形成水平的增加。與野生型（WT）METTL3的過表達相比，在ESCC細胞中METTL3非活性突變體的過表達未能促進細胞生長和增殖。這些結果有力地表明，METTL3促進腫瘤細胞增殖依賴于其表達水平和完整的活性。

為了確定METTL3在小鼠腫瘤生長中的作用，將KYSE180或KYSE450細胞皮下注射到裸鼠體內，發現METTL3缺失降低了腫瘤大小、體積和重量。與表達METTL3非活性突變體引起的有限效應相比，WT METTL3過表達極大地促進了腫瘤生長。這些結果表明METTL3的表達有助于小鼠腫瘤的生長。

METTL3 介導 APC mRNA 上的 m6A 上調

為了確定METTL3促進腫瘤細胞增殖的機制，檢測了METTL3在ESCC細胞上轉錄調節中的作用。METTL3缺失降低了KYSE180細胞中m6A的總豐度。甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）和m6A特異性抗體，然后進行RNA測序（MeRIP-seq），發現KYSE180的mRNA中鑒定的m6A位點與RRACH序列一致。m6A信號在mRNAs的終止密碼子和3′-非翻譯區富集。

在MeRIP-seq中METTL3缺失減少了1101個基因的mRNAs中1199個m6A峰。轉錄組測序發現METTL3缺失調節2973個基因的表達。二者取交集發現共有93個基因重疊。MeRIP-seq中細胞成分（CC）項的基因本體（GO）富集分析表明，在METTL3缺失的KYSE180細胞中，β-連環蛋白降解復合物（的基因組（包括APC）中m6A水平顯著降低。

APC是促進β-連環蛋白降解調節因子。m6A峰位于APC末端密碼子區域附近的最后一個外顯子，METTL3缺失降低了APC mRNA的m6A水平。分析顯示，有三個腺苷堿基甲基化，并且在METTL3缺失導致的APC mRNA m6A峰值下降范圍內。這些結果表明METTL3調節apcmrna的m6A水平，這種水平在許多類型的癌細胞中都很高。

m6A-RIP和實時定量PCR分析表明，在KYSE180細胞中，METTL3缺失后，APC mRNA中的m6A水平顯著降低。相反，METTL3過表達增加了KYSE180細胞中APC mRNA的m6A水平，并且這種增加被METTL14缺失所消除。此外，帶有抗METTL3的RIP顯示METTL3與KYSE180和KYSE450細胞中的APC mRNA結合。這些結果表明METTL3與apcmrna結合并以METTL14依賴的方式增強其m6A水平。

APC mRNA 上的 METTL3 依賴性 m6A 上調抑制 APC 表達

為了確定METTL3依賴的m6A調控對APC表達的影響，構建了一個熒光素酶報告基因，熒光素酶分析顯示，METTL3缺失大大增加了WT APC的熒光素酶活性，而突變的APC提高了熒光素酶活性并使該活性抵抗METTL3缺失的調節。相反，METTL3過表達抑制了WT-APC的熒光素酶活性，但沒有突變的APC。這些結果表明METTL3介導的m6A水平的APC mRNA上調抑制了APC的表達。

與這一發現一致，METTL3缺失增加了APC mRNA和蛋白質表達（，并且這些增加被KYSE450細胞中rMETTL3的重組表達所消除。此外，METTL3的過表達降低了KYSE450細胞中APC的表達，四環素劑量依賴性增加的METTL3表達水平與APC水平呈負相關。相反，METTL3非活性突變體與WT對應物不同，未能調節APC表達。值得注意的是，ESCC細胞中的METTL14缺失消除了METTL3的過度表達降低了APC的表達。這些結果表明，在ESCC細胞中，METTL3與METTL14共同介導的APC mRNA m6A上調抑制了APC mRNA和蛋白的表達。

METTL3 增強 APC mRNA 的 m6A 和隨后的 YTHDF 結合抑制 APC 表達

YTHDF1-3介導mRNA降解，針對YTHDF1的抗體進行RIP分析，實時定量PCR分析顯示，在KYSE180中，與APC mRNA結合的YTHDF2的數量遠遠多于YTHDF1和YTHDF3的數量，并且由于METTL3缺失而減少。這些結果表明METTL3增加了APC mRNA的m6A，在很大程度上促進了YTHDF2與APC mRNA的結合。

為了研究YTHDF2與APC mRNA結合在APC表達中的作用，我們去除了YTHDF2，這增加了KYSE450細胞中APC的mRNA（圖5d和補充圖5e）和蛋白質表達。YTHDF1–3的聯合缺失進一步增加了這些細胞中APC的mRNA和蛋白質表達。此外，還進行了熒光素酶報告子分析，結果表明，缺失YTHDF2增強了由含m6A的WT APC CDS序列驅動的熒光素酶活性，而突變的APC增強了熒光素酶活性，并使該活性抵抗了YTHDF2缺失的調節。此外，METTL3過表達抑制由WT APC CDS序列驅動的熒光素酶活性通過YTHDF2耗竭恢復，其不影響突變的APC增強的熒光素酶活性。這些結果表明METTL3增加了APC mRNA的m6A，隨后的YTHDF結合抑制了APC的表達。

METTL3降低APC表達，促進β-catenin介導的下游基因表達、有氧糖酵解、ESCC細胞增殖和腫瘤發展

APC功能的喪失使β-連環蛋白穩定，從而誘導下游基因（CCND1和MYC）的表達。CCND1促進細胞周期，c-Myc增強有氧糖酵解。正如預期的那樣，METTL3缺失增強了KYSE180細胞中APC的表達，降低了β-連環蛋白、細胞CCND1、c-Myc和PKM2的表達。此外，METTL3缺失降低了葡萄糖攝取、乳酸產生、細胞增殖和細胞集落數。值得注意的是，這種METTL3缺失引起基因表達（圖6a）、糖酵解（圖6b，c）、細胞增殖（補充圖6f）和集落形成的抑制在很大程度上被這些細胞中的APC缺失所消除。相反，METTL3過度表達引起葡萄糖消耗和乳酸產生的增加，這被YTHDF2消耗所消除。這些結果表明METTL3降低APC表達，促進β-catenin介導的下游基因表達、有氧糖酵解和ESCC細胞增殖。

為了確定METTL3誘導的APC表達下調在小鼠腫瘤生長中的作用，將KYSE180細胞皮下注射到裸鼠體內。發現通過APC去除，METTL3去除使腫瘤大小、體積和重量減小，并且腫瘤組織中的乳酸量恢復。此外，IHC染色顯示，METTL3缺失增加AP的表達，相應地減少了腫瘤組織中β-連環蛋白、cyclind1、c-Myc和PKM2的表達。這些結果表明METTL3抑制APC的表達可以促進腫瘤的發展。

APC表達下調與食管鱗癌標本METTL3上調及食管鱗癌患者預后不良相關

為了確定METTL3抑制APC表達的臨床相關性，分析TCGA數據， APC mRNA表達與ESCC中METTL3 mRNA表達呈負相關。發現與正常組織相比，ESCC標本中APC的表達顯著下調。81例ESCC標本的IHC染色觀察到METTL3蛋白表達與APC蛋白表達呈負相關，METTL3蛋白表達與β-連環蛋白表達呈正相關。此外，APC的高表達與ESCC患者的長期總生存時間顯著相關。這些結果提示APC表達下調與METTL3表達上調及ESCC患者預后不良相關。