乳腺癌是世界上女性發病率最高的惡性腫瘤。2018年全球新診斷乳腺癌約210萬例，約占所有女性惡性腫瘤病例的25%。環狀RNA（circRNA）是近年來在各種物種中廣泛發現的一類新RNA。由于共價環結構，circRNA 對 RNA 核酸外切酶具有抗性，并且比線性 RNA 更穩定。今天我們講一篇關于circRNA與乳腺癌的文章，題名為：The circACTN4 interacts with FUBP1 to promote tumorigenesis and progression of breast cancer by regulating the expression of proto-oncogene MYC。該文章發表在Molecular Cancer期刊上，IF=27.401。

USF2促進circACTN4在BC中的表達

為了研究 circRNA 在 BC發展中的功能，利用芯片分析檢測了4對BC組織和癌旁組織中circRNA表達特征。共發現85個顯著差異表達的circRNAs， 63 個上調和22個下調circRNAs。熱圖顯示了14個上調的circRNA，其中circACTN4是失調最嚴重的一個，差異高達10倍。根據circBase數據庫發現circACTN4來自位于人類19號染色體上的ACTN4基因，產生于ACTN4外顯子2至外顯子7（共571bp），通過 Sanger 測序驗證了反向剪接連接點。為了驗證circACTN4的環形結構，使用聚斂引物和發散引物擴增環狀 circACTN4 和線性 ACTN4。通過FISH和核質分離PCR觀察到circACTN4主要位于BC細胞的細胞核中， circACTN4在癌組織中的表達高于癌旁組織。，放線菌素D處理后的 qRT-PCR 和 RT-PCR 分析表明，circACTN4 在指定的時間點具有抗性。隨后，生物信息學預測上游轉錄因子2(USF2)可能與ACTN4的啟動子結合。因此，構建了攜帶全長野生型和突變型ACTN4啟動子的熒光素酶報告基因載體，結果表明USF2增強了熒光素酶野生型熒光素酶報告基因的活性。Chip-qPCR檢測進一步證明USF2可以與ACTN4基因啟動子結合并增強其轉錄活性。設計并構建了USF2過表達和敲低質粒，通過qRT-PCR檢測到轉染相應質粒的BC細胞中ACTN4的表達。結果表明，上調的 USF2 顯著增加了線性ACTN4和circACTN4的表達，而下調的USF2顯著降低了線性ACTN4和circACTN4的水平。這些結果表明ACTN4是轉錄因子USF2的靶基因。

circACTN4 在 BC 組織和細胞中高度表達并與臨床病理特征相關

為探討circACTN4的表達及其臨床意義，qRT-PCR檢測80對BC組織及鄰近非腫瘤組織中circACTN4的表達。circACTN4在BC組織中的表達顯著高于配對的癌旁組織。qRT-PCR檢測20對BC和癌旁組織中線性ACTN4的表達，數據顯示線性ACTN4在BC組織中高表達。Pearson相關分析顯示circACTN4的水平與BC組織中線性ACTN4的表達呈正相關。結果表明 circACTN4 和 ACTN4 的共過表達協同促進了乳腺癌的進展。RO曲線分析，circACTN4的AUC（曲線下面積）為0.719，診斷特異性和敏感性分別為70%和70。circACTN4 在 BC 細胞中的表達顯著高于正常乳腺上皮細胞 MCF-10A。接下來，評估circACTN4的表達與臨床病理特征的關聯。circACTN4的表達與年齡（P ?= 0.036）、T（P ?= 0.001）、N（P ?= 0.001）和TNM分期（P < 0.001）呈正相關，但與分級無關。利用ISH檢測包含240個 BC組織的組織芯片確定circACTN4的表達。Kaplan-Meier生存分析顯示，circACTN4高表達患者的總生存期比circACTN4低表達患者的總生存期短。circACTN4的表達與T分期、N分期和TNM分期呈正相關。Cox 比例風險模型評估 circACTN4 的預后價值。結果顯示circACTN4的過表達是BC患者預后不良的獨立預測因子（HR = 4.566，P <0.001）。circACTN4 可以發揮致癌作用，circACTN4 的高表達可以預測 BC 患者的不良預后。

circACTN4促進BC細胞增殖并調節細胞凋亡

為了探索 circACTN4 在 BC 細胞中的生物學功能，將circACTN4過表達質粒和circACTN4的siRNA轉染到BC細胞中。qRT-PCR驗證敲低過表達效率及不影響ACTN4線性轉錄本的表達水平。集落形成、EdU和CCK-8檢測表明 circACTN4的過表達顯著增強了BC細胞的增殖能力，而circACTN4的敲低顯著抑制了細胞活力。hoechst 33342染色顯示，轉染si-circACTN4后，BC細胞出現明顯的凋亡形態特征，包括熒光更強、核片段、染色質聚集和凋亡小體。使用AnnexinV/PI染色通過流式細胞術檢測細胞凋亡率，結果表明circACTN4敲低可以誘導BC的細胞凋亡。WB結果顯示，circACTN4 的下調導致更高水平的caspase-3和Bax以及更低的Bcl-2表達。

circACTN4 增加遷移和侵襲并調節 BC 細胞的細胞周期進程

為了進一步評估 circACTN4在BC進展中的作用，在 circACTN4 過表達或敲低后研究了 BC 細胞的遷移、侵襲和細胞周期。劃痕和transwell試驗表明，BC細胞的侵襲和遷移能力因 circACTN4 的上調而顯著增加，但被 circACTN4 的下調顯著抑制。WB結果發現過表達或敲低BC細胞中MMP9和MMP2蛋白水平明顯升高或降低，nm23-H1表達明顯降低或升高。式細胞術測定細胞周期分析，結果顯示與對照組相比，circACTN4的敲低導致S期BC細胞比例較低，G1期BC細胞比例較高，這表明circACTN4沉默導致G1期阻滯BC 細胞。此外，WB顯示BC 細胞中敲低 circACTN4 后，CDK4、CCNE1 和 CCND1 蛋白水平顯著下調，這可能阻止了 BC 細胞的細胞周期進程。

CircACTN4 直接與 FUBP1 相互作用并激活 MYC 的轉錄

為了探索circACTN4的分子機制，首先進行了pull down和質譜分析circACTN4結合蛋白，發現FUBP1在circACTN4上顯著富集。RIP 檢測進一步證實 FUBP1 可以通過qRT-PCR與BC細胞中的內源性circACTN4 特異性結合。FISH-IF 分析顯示 circACTN4和FUBP1共定位于細胞核中。但是circACTN4 的上調和敲低并沒有改變 FUBP1的表達水平，表明circACTN4不參與FUBP1的翻譯后調控。ChIP-PCR測定證實FUBP1與BC細胞中MYC啟動子結合。構建了 FUBP1 和 FIR 過表達和敲低質粒。通過qRT-PCR和蛋白質印跡確定轉染效率。qRT-PCR和WB的結果表明，FUBP1的上調或下調分別顯著增加或降低了BC細胞中MYC的表達水平。此外， qRT-PCR發現FUBP1在BC組織中的表達明顯高于鄰近正常組織中的表達。Pearson相關分析表明circACTN4的水平與BC組織中FUBP1的表達呈正相關。此外，MYC在BC組織中高表達，并與 FUBP1的表達呈正相關。為了確認ACTN4在BC中的生物學功能，構建了ACTN4過表達和干擾質粒，為了探究 circACTN4 的作用與 ACTN4 無關，進行了共轉染實驗，結果表明 ACTN4 敲低不影響促進作用circACTN4 對 MYC 轉錄的過度表達，ACTN4 的上調并沒有逆轉 qRT-PCR 和蛋白質印跡對 circACTN4 敲低對 MYC 表達的抑制作用。WB結果表明circACTN4可以促進MYC及其下游蛋白CDK4和CCND2的表達。這些數據表明 circACTN4 可以與 FUBP1 結合并促進 MYC 的表達。

circACTN4 和 FIR 與 FUBP1 競爭結合

推測circACTN4可以與FUBP1競爭性結合并阻止FIR與FUBP1結合以促進 MYC的轉錄和表達。為了進一步驗證提出的假設，qRT-PCR檢測了BC和匹配組織中FIR的表達，與正常相鄰組織相比，BC組織中FIR的表達顯著下調。Pearson相關分析表明，FIR的表達與BC組織中circACTN4、FUBP1和MYC的水平呈負相關。免疫共沉淀試驗結果表明，在過表達circACTN4的BC細胞的FUBP1-共免疫共沉淀物中未發現明顯的FIR蛋白帶，而在circACTN4被敲低后，通過蛋白質印跡在共免疫共沉淀物中明顯檢測到FIR，這表明上調的circACTN4顯著削弱FIR與 FUBP1的結合，同時下調 circACTN4 顯著加強了 FUBP1 和 FIR 之間的相互作用。ChIP分析結果表明，高濃度si-circ#2轉染后FIR和FUSE的結合水平高于低濃度si-circ#2轉染后FIR和FUSE的結合水平。此外，沉默 FIR 顯著增強了 MYC 的表達，而過表達 FIR 通過 qRT-PCR 和 BC 細胞中的蛋白質印跡降低了 MYC 的水平。OE-FIR 或 sh-FIR 與 circACTN4 或 si-circ#2 共轉染后，我們發現過表達 FIR 可以逆轉 circACTN4 對 MYC 表達的增強作用，而 FIR 敲低可以抵消下調的抑制作用qRT-PCR 在 MYC 水平上檢測到 circACTN4。總之，這些結果表明circACTN4可以抑制FIR和FUBP1的結合以減輕FIR的抑制作用，從而促進MYC轉錄。

FIR 逆轉 circACTN4 在 BC 細胞中的腫瘤促進作用

為了進一步研究 circACTN4 是否通過 circACTN4/FUBP1/MYC 軸發揮其生物學作用，在 OE-FIR 或 sh-FIR 與circACTN4或si-circ#2 共轉染后，在 BC 細胞中進行了一系列拯救實驗。結果表明，FIR 過表達可以顯著逆轉 circACTN4 上調在 BC 細胞增殖、遷移和侵襲中的促進作用，而 FIR 敲低通過傷口愈合、EdU 和 transwell 測定減弱了 BC 細胞中 circACTN4 下調介導的抑制作用。此外，IF 分析還表明 FIR 過表達和敲低可以明顯逆轉 circACTN4 上調和下調對 MYC 表達的影響。IF發現與癌旁組織相比，在BC 組織中 MYC 高表達。WB分析表明，FIR的上調和下調可以通過過表達和沉默circACTN4來抵消對MYC及其下游蛋白CDK4和CCND2表達的增強和抑制作用。綜上所述，上述結果進一步證明circACTN4可能與FUBP1競爭性結合，阻斷FIR對MYC的轉錄抑制作用，從而促進BC的腫瘤發生和進展。

CircACTN4促進體內異種移植腫瘤的發生和轉移

為了評估circACTN4在體內的致癌作用，通過皮下注射和尾靜脈注射在裸鼠中建立人BC細胞腫瘤模型。用過表達 circACTN4 慢病毒或 circACTN4 shRNA 慢病毒及其對照感染的 MCF-7 細胞接種雌性裸鼠。結果表明，circACTN4過表達組異種移植腫瘤的體積和重量明顯大于對照組，而circACTN4敲低顯著抑制了腫瘤生長。與對照組相比，circACTN4的上調明顯增加了轉移性肺結節的數量，而circACTN4沉默顯著抑制了自發性肺轉移，侵襲性腫瘤細胞較少。此外，circACTN4 的過表達可以顯著促進腫瘤血管生成，而 circACTN4 敲低顯著降低腫瘤微血管密度。WB結果顯示，與對照組相比，過表達或沉默circACTN4組的異種移植腫瘤組織中MYC的蛋白質水平分別顯著增加或減少。生物發光成像結果顯示，在circACTN4過表達組中檢測到更強和更多的生物發光信號，而circACTN4沉默組中的小鼠與對照組相比顯示出更少的生物發光轉移數量。與對照組相比，circACTN4 過表達組的小鼠總體存活率較低，肝轉移范圍更廣。最后，我們通過 IHC 確定了 circACTN4 對其靶蛋白 MYC、下游細胞周期相關蛋白 CDK4 和 CCND2 以及細胞增殖相關蛋白 Ki67 的影響。結果表明，circACTN4的上調可以增加腫瘤組織中MYC、CDK4、CCND2和Ki67的表達，而circACTN4的沉默降低了這些蛋白質的表達水平。綜上所述，上述結果進一步證明了circACTN4在乳腺癌中的致癌作用，提示circACTN4可以通過激活原癌基因MYC促進乳腺癌的發生和轉移。