巨噬細胞的差異激活與腫瘤進展密切相關，而表觀遺傳因子賴氨酸去甲基化酶6B (KDM6B，先前命名為JMJD3)通過一種未知的機制調節巨噬細胞的極化。本文探討了該調解機制及其功能，并于2021年5月發表在《Theranostics》IF:8.579期刊上。

技術路線：

主要實驗結果如下：

1、巨噬細胞KDM6B的表達被miR-138-5p抑制

根據文獻報道KDM6B是巨噬細胞的激活的關鍵分子，因此，作者首先檢測了乳腺癌細胞系MB-MDA-231對巨噬細胞系TPH-1中KDM6B表達的影響，結果表明乳腺癌細胞及其條件培養基都可顯著下調KDM6B的表達，表明存在一種乳腺癌細胞來源的分泌因子產生此種影響。因此，通過生物信息學預測了KDM6B結合的miRNA，以及結合文獻，通過在乳腺癌中上調的，同時符合條件的有3個。隨后將乳腺癌細胞和巨噬細胞共培養，檢測三個miRNA的表達，如圖1B所示，只有miR-138-5p和miR-146a的表達在共培養后顯著上調。進一步檢測發現，只有miR-138-5p處理后KDM6B的表達顯著下降而非miR-146a（圖1C-D）。生信分析預測了miR-138-5p和KDM6B的結合位點，并進行了熒光素酶實驗檢測，證實了兩者間存在結合關系。

圖1 miR-138-5p抑制巨噬細胞KDM6B的表達

2、miR-138-5p介導癌細胞誘導的巨噬細胞KDM6B表達抑制

構建了miR-138-5p過表達的乳腺癌細胞系，取其培養基與巨噬細胞共培養，結果巨噬細胞中miR-138-5p表達顯著上調，同時KDM6B的表達顯著下降。證實miR-138-5p介導癌細胞誘導的巨噬細胞KDM6B表達抑制。

圖2 miR-138-5p介導癌細胞誘導的巨噬細胞KDM6B表達抑制

3、癌細胞來源的外泌體miR-138-5p下調KDM6B的表達

隨后為了判定上述巨噬細胞中miR-138-5p表達上調的原因，檢測了巨噬細胞中原代(pri-)和前體(pre-) miR-138的水平。結果顯示共培養和對照組間原代和前體miR-138的水平沒有差異，表明miR-138-5p是外源供應的（圖1A）。此外，使用RNase A處理miR-138-5p水平不變，使用Triton X-100其水平顯著下降。提示miR-138-5p被膜狀結構包裹（圖1B）。進一步分析表明使用外泌體抑制劑GW4869處理組和外泌體刪除組的培養基中miR-138-5p的表達顯著下降（圖1C）。表明外泌體來源于乳腺癌細胞。類似的，外泌體抑制劑GW4869處理導致共培養的巨噬細胞中miR-138-5p的水平顯著下降，而KDM6B的水平顯著上升（圖1D-E）。乳腺癌細胞外泌體增加TPH-1細胞中miR-138-5p的表達但抑制KDM6B的表達，但這種作用被miR-138-5p抑制劑處理廢除（圖3F-G）。轉染miR-138-5p mimic的乳腺癌細胞增加了外泌體miR-138-5p的水平（圖3H）。過表達miR-138-5p的乳腺癌細胞外泌體增加了miR-138-5p水平，抑制了THP-1細胞中KDM6B的表達（圖3I-J）。總之，這些結果表明，癌細胞分泌的外泌體miR-138-5p被傳遞到巨噬細胞中，并抑制KDM6B。

圖3 癌細胞來源的外泌體miR-138-5p下調KDM6B的表達

4、外泌體miR-138-5p通過抑制KDM6B表達調節巨噬細胞極化

隨后，作者研究了在不同培養條件下TPH-1的表達譜。首先，和腫瘤細胞共培養抑制了M1相關基因的表達，IL-6，TNF-α，和IL-1β，但是增加了M2相關基因的表達CD163，Arg-1，IL-10,TGF-β和VEGFA。過表達KDM6B部分抑制了上述表現改變（圖4A-B）。流式檢測顯示乳腺癌細胞和TPH-1的共培養增加了CD163陽性細胞數比例，但是過表達KDM6N可以抑制這種效果（圖6C）。類似的，過表達KDM6B抑制了miR-138-5p誘導的M2極化（圖4D-F）。與對照組相比，乳腺癌來源的外泌體miR-138-5p降低了M1相關表型，相反，M2標志物增加并伴隨著CD163陽性細胞數的增加（圖6G-I）。用從乳腺癌細胞中分離出來的外泌體處理THP-1細胞導致了M2極化，抑制miR-138-5p的表達可挽救這種極化（圖4J-L）。總之，這些結果表明外泌體miR-138-5p通過抑制KDM6B表達調節巨噬細胞極化。

圖4 外泌體miR-138-5p通過抑制KDM6B表達調節巨噬細胞極化

5、KDM6B去甲基化酶活性增加了M1相關基因的表達

抑制KDM6B的組蛋白去甲基化酶活性可抑制其靶基因的轉錄。因此，使用雙熒光素酶實驗來分析M1靶基因的啟動子活性。KDM6B的過表達特異性地刺激了促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α編碼基因的啟動子活性（圖5A）。相反，沉默KDM6B活性則導致他們的啟動子活性抑制，而過表達KDM6B降低了H3K27me3的水平（圖5B）。ChIP檢測顯示，與對照相比，THP-1細胞中KDM6B的過表達或敲除顯著增加或減少了KDM6B啟動子在不同區域的占用(圖5C-D)。與此結果一致，啟動子區域H3K27me3的募集會降低或增加當KDM6B過表達或沉默時（圖5E-F）。總之，下調KDM6B可提高H3K27me3水平和促炎因子編碼基因的轉錄活性，導致抑制M1極化。

圖5 KDM6B去甲基化酶活性增加了M1相關基因的表達

6、外泌體miR-138-5p促進乳腺癌肺轉移

極化的巨噬細胞在決定腫瘤細胞的表型中起著重要的作用。因此，探究M2巨噬細胞外泌體miR-138-5p處理是否有助于乳腺癌小鼠異腫瘤模型的腫瘤轉移。使用氯膦酸鈉清除小鼠巨噬細胞，然后轉移使用過表達miR-138-5p的T47D或T47D細胞來源的外泌體處理的Raw264.7細胞。小鼠模型通過尾靜脈注射4T1-熒光素酶細胞構建（圖6A）。結果顯示，外泌體miR-138-5p處理組顯著促進小鼠體內乳腺癌細胞的腫瘤體積和肺轉移，同時增加了CD206和Arg-1陽性細胞數（圖6B-E）。這些結果表明外泌體miR-138-5p誘導的M2巨噬細胞促進乳腺癌的肺轉移。

圖6 外泌體miR-138-5p促進乳腺癌肺轉移

參考文獻：

Xun Jing., Du Lingfang., Gao Ruifang., Shen Long., Wang Dekun., Kang Lichun., Chen Chuan'ai., Zhang Zhujun., Zhang Yuying., Yue Shijing., Feng Shuxin., Xiang Rong., Mi Xue., Tan Xiaoyue.(2021). Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics, 11(14), 6847-6859. doi:10.7150/thno.51864