創傷性腦損傷（TBI）是重要的健康問題，每年有超過5000萬新發TBI病例。在TBI的病理生理過程中，會發生各種形式的細胞死亡，包括細胞凋亡，壞死，程序性壞死，自噬，焦亡和鐵死亡。目前尚未充分挖掘TBI中鐵死亡的發病機理。今天我們講一篇蘇州大學團隊在JOURNAL OF PINEAL RESEARCH（IF=14.526）期刊發表的題名為Deletion of ferritin H in neurons counteracts the protective effect of melatonin against traumatic brain injury-induced ferroptosis的文獻。該文獻主要講述褪黑素通過FTH調節TBI中鐵死亡。

1. 褪黑素可減輕TBI引起的鐵死亡

為了確定褪黑素是否可以挽救TBI引起的鐵死亡，在相應的高峰表達（例如1天和3天）進行了與鐵死亡相關蛋白的蛋白質印跡分析。發現褪黑素給藥在TBI后1天抑制了TBI誘導的xCT，Cox2，Tfr1，Fpn和Nox2蛋白表達的上調。同樣，褪黑素治療在TBI后3天阻止了Fth，Ftl和4HNE蛋白的表達。用促鐵蛋白抑制劑liproxstatin-1（Lip-1）也獲得了相似的結果。此外，免疫組化染色顯示，與對照組相比在TBI后第7天，褪黑素和Lip-1的處理減少了神經元中4HNE陽性細胞的數量，表明褪黑素對TBI誘導的脂質具有神經保護作用過氧化。褪黑素和Lip-1均抑制TBI誘導的皮質GSH水平降低。褪黑素和Lip-1抑制TBI誘導3天后損傷皮層中MDA含量的上調。這些數據表明，TBI導致了與鐵死亡相關蛋白表達的時間變化，以及同側皮層中某些受推定的鐵死亡生物標志物的變化，但是用褪黑素有效地挽救了TBI誘導的鐵死亡。

2. 褪黑素可挽救TBI后皮層的鐵蓄積和神經元損傷

為了進一步研究褪黑素在TBI后鐵蓄積和神經元損傷中的假定作用，在TBI后第3天，在受傷的皮層中觀察到了Fe^{2 +}，Fe³⁺，總鐵含量顯著增加。而褪黑素或Lip-1抑制TBI誘導的血清和同側皮層中鐵含量的上調的。Perls的藍色染色表明，TBI后第7天鐵陽性細胞的數量顯著增加，褪黑素或Lip-1治療組的鐵陽性細胞少于對照組。鑒于TBI誘導的鐵超載伴隨著Fth表達的上調，使用免疫熒光染色觀察了TBI后神經元中Fth的表達。發現與假手術組相比，模型組中Fth陽性神經元的顯著增加，而褪黑素和Lip-1處理顯著降低了Fth陽性神經元。與假手術組相比，受傷的神經元的細胞體在TBI后7天出現胞質萎縮或核固縮。褪黑素和Lip-1處理可減輕這些組織病理學變化。TBI后第7天， FJB染色測定腦部神經元變性，發現TBI導致大腦皮層變性神經元的數量增加，但是褪黑素和Lip-1給藥明顯減少了變性神經元的數量。這些數據表明褪黑素可防止TBI誘導的鐵蓄積并防止同側皮質的神經元損傷。

3.  MT2受體可能參與褪黑素對TBI引起的鐵死亡的保護作用

為了闡明褪黑素的保護TBI作用是否依賴于褪黑素受體，首先確定了TBI后褪黑素受體（MT1和MT2）的表達模式。從12小時到14天觀察到皮質MT1和MT2表達顯著降低。此外，褪黑素可在24小時顯著改善褪黑素治療的TBI小鼠大腦中MT1和MT2的損失。為了確定褪黑素的受體是否參與褪黑素對TBI引起的鐵死亡的保護作用，當用Luzindole（褪黑素受體拮抗劑）或4P-PDOT（一種選擇性MT2受體拮抗劑）預處理小鼠時，我們發現用Luzindole和4P-PDOT進行的預處理均消除了TBI后24小時褪黑素對MT1和Cox2表達的影響。值得注意的是，用4P-PDOT預處理消除了褪黑素對MT2表達和GSH含量的修復作用，以及褪黑素對xCT和4HNE的影響。本研究的數據表明，MT2受體是主要的褪黑素受體亞型，可能參與了褪黑素對TBI引起的鐵死亡的保護作用。

4. 褪黑素可減少TBI誘發的小鼠腦行為缺陷和病變體積

為了利用褪黑素對TBI誘導的神經系統結果和病變體積的影響，進行了行為分析以及HE染色。關于線握測試，與假手術組相比，TBI在第1-8天導致運動表現顯著下降，但與TBI組相比，褪黑素和Lip-1的治療改善了第2-6天的運動表現。在MWM測試中觀察到，與假手術組相比，TBI在第10-15天導致潛伏期延長，但是褪黑素和Lip-1治療的TBI小鼠均表現出比TBI小鼠明顯更短的逃避潛伏期。曠場試驗中，與假手術組相比，TBI組的動物的總距離、中心移動距離和花費時間明顯縮短。褪黑素治療可顯著逆轉上述參。HE染色顯示，褪黑素和Lip-1治療的TBI組在TBI后第16天的病變體積明顯小于TBI組。兩者合計，結果提供了褪黑素治療小鼠中TBI后改善運動，記憶和焦慮結局以及病變體積的證據。

5. 在基礎條件下，Fth -KO小鼠皮層中鐵穩態輕度受損

使用蛋白質印跡分析，實時PCR和Fth免疫熒光證實了在基礎條件下神經元Fth表達的喪失。Fth- KO小鼠的FTH mRNA和蛋白表達較低。我們還通過免疫熒光觀察了Fth的神經元水平。從他莫昔芬處理的皮層神經元Fth- KO小鼠具有減少的免疫原性FTH的。重要的是，在神經元中觀察到幾乎罕見FTH陽性細胞Fth- KO小鼠。有趣的是，神經元中Fth的喪失并未導致Ftl表達的代償性增加。接下來，檢查了神經元Fth在鐵代謝和氧化還原穩態中的假定作用。Fth-KO組與對照組相比，皮質Fe2 +，Fe3+，總鐵水平顯著增加。Perls的藍色染色顯示在生理條件下，在Fth- KO中觀察到的鐵陽性細胞相對較少。這些結果表明，Fth- KO小鼠具有活力和繁殖力，但鐵代謝發生了改變，這提供了神經元鐵蛋白的鐵存儲功能在維持皮質鐵穩態基礎條件中起重要作用的證據。

6.  Fth -KO小鼠易患TBI引起的鐵死亡

為了進一步研究神經元Fth在TBI誘導的鐵死亡中的作用，首先研究了神經元Fth在TBI誘導的皮質鐵超負荷中的作用。與對照小鼠相比，Fth- KO小鼠在TBI后受損皮層和血清中出現了更嚴重的鐵過載。Fth- KO小鼠的皮質非血紅素鐵水平更高，并且Fth- KO小鼠Tfr1表達沒有明顯變化，而Fpn表達卻明顯降低。然后，在Fth- KO小鼠皮質的SLC7A11 mRNA顯著增加和PTGS2 mRNA無顯著變化。WB分析顯示XCT的顯著增加。th-KO小鼠在第1天之后TBI在降低皮質GSH水平F，相對于對照小鼠。發現TBI后3天，Fth-KO小鼠的皮質MDA水平顯著增加。此外， TBI后Fth-KO小鼠受損皮層中4HNE陽性細胞數量增加，表明脂質過氧化水平增加；在TBI后受傷側的KO小鼠中FJB陽性神經元的數量顯著增加，表明Fth缺乏導致TBI后神經元損傷加重。綜上所述，這些結果表明，由于Fth- KO小鼠對鐵蓄積的敏感性增加，因此更容易受TBI誘導的鐵死亡的影響，這提供了神經元Fth喪失導致TBI誘導的鐵死亡的證據。

7. 在Fth- KO小鼠中， TBI后褪黑素對神經的保護作用被大大取消

為了進一步探索神經元Fth的喪失是否影響褪黑素對TBI誘導的鐵死亡的影響，測量了鐵死亡的幾種假定的生物標志物。發現治療KO小鼠上皮層非血紅素鐵的水平沒有影響。令人驚訝的是，盡管褪黑素治療的和未治療的Fth -KO小鼠的Tfr1 mRNA和蛋白表達水平沒有顯著差異，但是在褪黑素治療的小鼠中，觀察到Fpn mRNA和蛋白表達水平顯著增加Fth- KO小鼠。值得注意的是，與未治療的Fth- KO小鼠相比，用褪黑素治療Fth- KO小鼠未能顯著改變mRNA（Slc7a11，Ptgs2）和蛋白質（xCT，Cox2、4HNE）的表達。另外，用褪黑素治療Fth- KO小鼠并沒有統計學上降低GSH和MDA以及4HNE的水平，和FJB陽性細胞的數目。這些結果表明褪黑素沒有統計學上減少TBI引起的鐵死亡和神經元變性。

8. 褪黑素不能挽救Fth 敲低HT-22細胞中機械性損傷引起的鐵死亡

為了進一步證實褪黑素對Tth小鼠在Fth- KO小鼠中的上述作用，將HT-22細胞系用siRNA轉染，然后在體外進行機械刮擦損傷。siRNA敲低Fth可以降低Fth的蛋白質水平。鑒于脂質過氧化是鐵死亡的標志，使用DCF和BODIRY 581/591 C11作為評估了溶質ROS。與對照組+刮擦損傷組相比，siFth +刮擦損傷組細胞的熒光強度顯著增加，表明siFth增強了HT-22細胞中機械刮擦損傷引起的ROS產生的上調。重要的是，與未經治療的siFth組相比，用褪黑素處理siFth轉染的HT-22細胞未能顯著減少刮擦損傷后ROS的上調。另外，相對于對照組，在生理條件下，單獨使用siFth不能顯著增加ROS的產生。對鐵死亡的抗性與抑制BODIRY-C11氧化有關。與上述ROS結果一致。測量了鐵死亡的幾種推定生物標志物，包括xCT，Cox2和4HNE表達。如預期的那樣，與對照組+刮擦損傷組相比，在siFth轉染的HT-22細胞中，刮擦損傷的xCT表達顯著下降，而Cox-2和4HNE的表達顯著增加。重要的是，與未經治療的siFth組相比，用褪黑素處理siFth轉染的HT-22細胞在刮傷后未能顯著改變xCT，Cox2和4HNE的表達。另外，在生理條件下，單獨的siFth與對照組之間上述蛋白質的表達沒有顯著差異。這些結果表明，用siFth轉染的HT-22細胞易受機械性刮擦損傷誘導的脂質過氧化和鐵死亡的影響，而褪黑素在統計學上并未減輕損傷后的鐵死亡，并且siFth不會影響褪黑素受體的表達。