磷酸肌醇3-激酶(PI3K)信號通路在癌癥中經常過度激活。在胞外刺激下，I類PI3K在質膜內葉上轉化為磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PI(3,4,5)P3)，通過肌醇聚磷酸5-磷酸酶快速轉化為磷脂酰肌醇3,4-二磷酸(PI(3,4)P2)。PI(3,4,5)P3和PI(3,4)P2共同增加了致癌PI3K信號的中樞效應蛋白激酶AKT2,3的招募和激活。PI(3,4,5) P3/PI(3,4)P2信號通路激活質膜上的許多其他效應因子，包括蛋白激酶PDK1，該蛋白激酶進而磷酸化AKT和其他AGC激酶，如SGK34。腫瘤抑制因子，磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)，將PI(3,4,5)P3轉化為PI(4,5)P2，從而抑制PI3K/AKT信號。II類肌醇多磷酸4-磷酸酶(INPP4B)可使I類PI3K下游的PI(3,4)P2去磷酸化，形成磷脂酰肌醇3-磷酸(PI(3)P)，也可抑制AKT信號，并被認為在某些癌癥中起抑癌作用。

編碼PI3Kα p110α亞基的PIK3CA在多達40%的乳腺癌中發生突變，最常見的是雌激素受體陽性(ER+)腫瘤。突變的PIK3CA在校正ER陽性等有利風險變量時并不是預后的獨立標記物，但它是改善晚期ER+乳腺癌內分泌和PI3K聯合治療應答的預測生物標記物。有趣的是，與PTEN等其他PI3K通路改變的腫瘤相比，pikca突變ER+乳腺癌顯示出極少的AKT激活和對AKT信號的依賴。

NPP4B抑制AKT信號，并在三陰性(ER /PR /HER2)和基底樣乳腺癌中表現出腫瘤抑制活性。此外，INPP4B蛋白在黑色素瘤、卵巢癌和前列腺癌中表達減少。在小鼠模型中，Inpp4b消融與Tp53/Brca1缺失共同增加了乳腺腫瘤外顯率，并與Pten雜合子缺失共同促進體內甲狀腺腫瘤的發生和轉移。值得注意的是，INPP4B通過降解PI(3,4)P2，抑制早期核內體的局部AKT2信號通路和EGFR降解。

最近的研究表明INPP4B可能在與化療耐藥性相關的急性髓系白血病(AML)中起致癌作用，以及在黑素瘤和結腸癌中起致癌作用。而且可能與環境有關。例如，在乳腺癌中，SGK3被擴增，它的激酶活性依賴于致癌的PI3K和INPP4B。最近，INPP4B被確定為與ER+乳腺癌和腫瘤分級相關的頂級基因。

2021年5月，在Nature communications 雜志上發表了文章“INPP4B promotes PI3Kα-dependent late endosome  formation and Wnt/β-catenin signaling in breast  cancer”。此報道探討了INPP4B在ER+乳腺癌中的作用，揭示了一組pik3c突變ER+乳腺癌表現出INPP4B表達增加。盡管同時抑制AKT信號，但過表達INPP4B可以促進pik3a突變ER+乳腺癌細胞系的增殖和腫瘤生長。為了研究這一明顯的悖論，使用了蛋白質組學、轉錄組學和先進的細胞成像的綜合方法來闡明INPP4B促進pik3a突變ER+乳腺癌發生的分子機制。結果顯示INPP4B刺激晚期核內體上pi3k α依賴的信號樞紐，指導Wnt/β-catenin的激活。這些研究揭示了促進細胞增殖和腫瘤生長的兩種致癌信號通路之間的串擾機制。

技術路線：

一、在pik3a突變的ER+乳腺癌中，INPP4B的表達增加

INPP4B被確定為人類乳腺癌er陽性標記物.INPP4B在三陰性乳腺癌中表達缺失，然而，它作為其他癌癥中潛在的致癌基因的出現，促使我們檢測其在ER+乳腺癌中的相對表達和功能。INPP4B蛋白表達缺失與三陰性乳腺癌相關(圖1a, b) 增加INPP4B蛋白表達在14 40%的乳腺癌相對于正常組織與ER / PR-positivity和腔內(ER +和/或PR+)乳腺癌亞型(圖1 a, b和補充圖1 b, c)。在mRNA表達數據不能用于這些cohorts使用組織掃描乳腺癌cDNA陣列I IV (OriGene)檢測130例原發人類乳腺癌和16例正常乳腺組織的INPP4B mRNA表達(圖1c)。INPP4B表達降低與三陰性乳腺癌相關，而顯著增加的INPP4B表達在25%的乳腺癌中與ER/ propositivity和luminal亞型相關(圖1c, d和補充圖1d, e)。使用METABRIC和TCGA數據集，我們發現只有1%的乳腺癌表現出INPP4B基因改變，如突變、截斷、擴增或缺失。INPP4B mRNA表達與PTEN或AKT1突變無關，但與pik3a突變狀態正相關(圖1e和補充圖1f)。在PIK3CA多突變的乳腺癌中，INPP4B的表達也顯著升高(補充圖1g)。進一步分層研究發現，INPP4B高表達與pik3c突變ER+乳腺癌亞型特異性相關(圖1f)。

二、INPP4B增強pik3a突變ER+乳腺癌和乳腺上皮細胞增殖

GFP-INPP4B在MCF-7和T47D ER+乳腺癌細胞中表達，這兩種細胞分別有PIK3CAE545K和PIK3CAH1047R高活化突變.癌細胞進行非錨定細胞生長的能力是細胞轉化的一個標志。GFP-INPP4B顯著增加了軟瓊脂中MCF-7細胞集落大小(2.1倍)和T47D細胞集落大小(1.8倍)，但對集落數量沒有影響(圖2a-c)。與細胞增殖增加相一致。與載體對照相比，GFP-INPP4B在血清剝奪后增強了MCF-7細胞的增殖(1.7倍)(圖2d, e)，但不影響在含血清培養基中生長的MCF-7細胞的增殖。過表達GFPINPP4B的MCF-7細胞中，egf刺激的AKTS473和AKTT308磷酸化水平略有降低(圖2f-h)。表達MCF-10A腺泡的Myc-INPP4BWT而不是Myc-INPP4BC842A (PI (3,4)P2 4-磷酸酶死亡)的腺泡(補充圖2k)顯示增殖細胞的百分比明顯高于病媒控制的腺泡(1.5倍)(圖2i, j)。在第7天，腺泡的大小沒有明顯變化(圖2k)。第14天，Myc-INPP4BWT而不是MycINPP4BC842A表達MCF-10A的細胞形成了更大的腺泡(1.8倍)，每個腺泡的細胞數量比載體對照增加了1.4倍(圖2l n)。過表達INPP4B促進MCF-10A細胞增殖，但不影響細胞的尖基底極性和細胞凋亡。與此一致的是，過表達Myc-INPP4BWT而不是Myc-INPP4BC842A在血清剝奪后的單層培養中增強了MCF-10A細胞的增殖(1.7倍)(圖2o, p)。

總之，這一數據與INPP4B以PI(3,4)P2 -磷酸酶依賴的方式促進pik3a突變體ER+乳腺癌和pik3a野生型乳腺上皮細胞增殖的解釋相一致。

三、INPP4B促進晚期核內體上PI(3,4)P2到PI(3)P的轉化

使用了幾種基于無偏性蛋白質組學的技術來表征INPP4B在pik3a突變ER+乳腺癌中的下游信號功能。首先，利用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)進行全細胞蛋白質組學研究，確定GFP-INPP4B與gfp載體表達MCF-7細胞中蛋白水平的差異(2倍)。功能注釋分析顯示，inpp4b過表達細胞中上調的蛋白與內溶酶體系統密切相關，內溶酶體系統是介導細胞外受體和貨物內化和降解的囊泡運輸途徑(圖3a)。免疫沉淀質譜(IP-MS)對受EGF刺激的MCF-7細胞進行GFP-INPP4B蛋白復合物的分析，以激活I類PI3K信號。從該分析中鑒定出的最富集的結合伙伴是RAB7A (Rab7)，這是一種定位于晚期核內體的小GTPase(圖3b)。GFP-INPP4B與內源性Rab7的共免疫共沉淀證實了INPP4B與Rab7的結合(圖3c)。通過免疫電鏡進一步分析INPP4B定位于晚期核內體，結果顯示GFPINPP4B定位于晚期核內體的限制膜和內膜(圖3d)，之前的研究已經確定了PI(3,4)P2和PI(3)P。在皂苷處理的MCF-7細胞中，觀察到內源性INPP4B與HARab7WT或HA-Rab7Q67L共同定位于cd63陽性的晚期核內體(圖3e)。HA-Rab7T22N是一個不定位于晚期核內體的顯性陰性突變體(補充圖3f)，它的表達也阻止了內源性INPP4B的募集(圖3e)，表明活性的gtp結合的Rab7是INPP4B亞細胞定位到晚期核內體所必需的。 GFP-INPP4B顯著提高了細胞內PI(3)P水平(1.8倍)(圖3f)，PI(3,4)P2也存在于早期和晚期核內體。表達INPP4B shrna的MCF-7細胞顯示出更明顯的細胞內PI(3,4)P2斑點，表明INPP4B缺失抑制PI(3,4)P2在核內體上的降解，導致其積累(圖3g)。GFP-INPP4B沒有改變PI(3) p陽性早期核內體的比例，但顯著增加了PI(3) p陽性晚期核內體的比例(1.7倍)(圖3h, i)。

四、INPP4B促進pi3k α依賴的晚期核內體形成

五、阻斷atm依賴的磷酸化會損害DNA損傷后PTEN的亞細胞再分配

對MCF-7細胞內溶酶體室的檢查顯示，GFP-INPP4B不影響eea1陽性的早期內溶體，但顯著增加了cd63陽性的晚期內溶體(2.5倍)和lamp1陽性的溶酶體(1.7倍)(圖4a, b)。

提示INPP4B促進晚期內吞體/溶酶體的形成。使用bsa -gold標記MCF-7細胞內溶酶體室，在電鏡下進行超微結構分析。GFP-INPP4B增加了類似晚期核內體的bsa陽性空泡結構的數量(圖4c)。利用染料淬滅的BSA (BSA- dq)檢測了運往溶酶體的貨物運輸，BSA- dq通過液相內吞進入內吞體，溶酶體水解酶隨后促進去淬和激活熒光信號。GFP-INPP4B顯著增加了bsa - dq陽性結構的數量(2倍)(圖4d, e)，表明INPP4B增強了內吞貨物通過晚期內吞體到溶酶體的運輸。相比之下，使用泛I類PI3K抑制劑BKM120、PI3Kα特異性抑制劑BYL719(補充圖5f)或使用兩種不同的siRNAs耗盡PIK3CA抑制GFP-INPP4B細胞中晚期核內體形成的增加(圖4f, g和補充圖5i, j)。通過在晚期核內體上產生PI(3)P, INPP4B通過Hrs促進晚期核內體的形成。顯著的shrna介導的Hrs耗散(補充圖6a, b)導致gfp載體細胞中cd63陽性晚期核內體減少，并將GFPINPP4B細胞中晚期核內體形成增加的水平逆轉為gfp載體控制水平(圖5a, b)。在非錨定細胞生長試驗中，耗用Hrs shRNA對gfp載體軟瓊脂集落的大小沒有影響，但減少了GFP-INPP4B細胞集落的大小，這與Hrs依賴的細胞增殖一致(圖5c, d)。將MCF-7細胞注射到雌性BALB/c裸小鼠腹股溝第四乳腺脂肪墊中，在體內檢測腫瘤生長的hrs依賴性。與GFPvector相比，GFP-INPP4B在體內腫瘤體積和體外腫瘤重量顯著增加(3倍)(圖5e g)。雖然敲除Hrs沒有影響gfp載體腫瘤的大小和重量，但GFP-INPP4B腫瘤的增強生長被減少Hrs抑制(圖5e g)，表明INPP4B促進pik3a突變ER+乳腺癌細胞的增殖和腫瘤生長以hrsdependence的方式。

六、INPP4B通過增強GSK3β的溶酶體降解促進pi3k依賴的Wnt/β-catenin信號轉導

通過nanoString RNA譜分析，我們檢測了GFP-INPP4B和gfp載體表達MCF-7細胞中已知的癌癥通路，結果顯示幾種Wnt/β-catenin通路基因的表達發生了改變(圖6a)。定量RTPCR證實GFP-INPP4B-MCF-7細胞中Wnt/β-catenin靶基因AXIN2(1.8倍)、LEF1(5.6倍)、DKK1(3.3倍)和MYCN(2倍)的mRNA表達增加，表明Wnt/β-catenin信號通路增加(圖6b)。它結合TCF/LEF轉錄因子，促進Wnt靶基因的轉錄。Wnt/β-catenin信號通路被Wnt3a和R-spondin處理激活，在這些條件下，與gfp載體對照相比，GFP-INPP4B細胞表現出AXIN2 mRNA表達和非磷酸化-β- catenins33 /S37/T41(活性-β-catenin)水平增加(圖6c, d)。此外，GFP-INPP4B的表達在基礎和wnt刺激條件下降低了GSK3β蛋白水平，與GSK3β的增強破壞一致(圖6d)。通過Hrs shRNA消耗抑制晚期核內體形成后，降低的GSK3β蛋白水平得以恢復(圖6f, g)。GFP-INPP4B而不是gfp載體細胞表現出明顯的GSK3β蛋白酶保護，這與GSK3β向晚期核內體轉運的增強相一致(圖6h)。免疫熒光證實了這一點，在GFP-INPP4B中觀察到RFP-GSK3與LysoTracker共定位，這是一種積累在晚期核內體/溶酶體中的染料，而不是gfp載體細胞(圖6i)。

利用METABRIC數據集，我們評估了1459例ER+乳腺癌中17個常見Wnt/β-catenin通路基因的表達，包括幾個Wnt靶基因(圖7a)。為了確定INPP4B是否促進PI3K和Wnt/β-catenin通路之間的對話，我們用增加劑量的PI3K抑制劑BKM120(0.5和1 M)處理gfp載體和GFPINPP4B MCF-7細胞，并測量Wnt靶基因AXIN2、LEF1和MYCN的mRNA表達(圖7b d)。在gfp載體細胞中，低劑量的BKM120對Wnt靶基因表達的影響最小，而高劑量的Wnt基因表達降低。在GFP-INPP4B表達細胞中，低濃度的BKM120部分挽救了Wnt基因表達的增加，在更高濃度時進一步降低?？傊@些發現與INPP4B促進Wnt/β-catenin信號轉導，從而通過增強晚期核內體形成促進pik3a突變ER+乳腺癌細胞的增殖的解釋相一致(圖7e)。