肝細胞癌(HCC)是全球第四大致命惡性腫瘤類型。然而，參與HCC進展的確切分子機制尚不清楚。本研究發現缺氧誘導的CFL1通過激活PLD1/AKT通路增加HCC的增殖、遷移、侵襲和EMT。本文于2021年3月發表在《Clinical and Translational Medicine》IF：7.919期刊上。

技術路線：

主要實驗結果：

1、CFL1在HCC中高表達

門靜脈瘤血栓(PVTT)是HCC預后不良的重要危險因素。取3對HCC和配對的PVTT組織進行iRTAQ檢測，挖掘到946個差異表達蛋白。圖1A列舉了最顯著上調的10個蛋白，其中CFL1在HCC中顯著高表達。WB和免疫組化表明CFL1在癌旁組織，HCC和PVTT組織中表達逐漸上調（圖1B-C）。隨后在100對HCC和癌癥組織，以及6株細胞系中檢測了CFL1的表達，證實CFL1在HCC中高表達。

圖1  PVTT、HCC及癌旁非腫瘤組織中CFL1的表達

2、CFL1的高表達與HCC的不良預后相關

單變量分析顯示，腫瘤大小、腫瘤數量、TNM分期、靜脈浸潤、HBV感染和CFL1水平與HCC患者的總體生存率顯著相關（表2）。多變量分析顯示，僅腫瘤大小、腫瘤數量、靜脈浸潤和CFL1水平是HCC總體生存率的獨立預后指標（表2）。并且，可以看出CFL1的高表達與HCC的不良預后相關。

3、CFL1促進HCC的增殖，遷移和侵襲

如圖2所示，在高表達CFL1的HCCLM3和MHCC97h細胞中，敲除CFL1 (圖2A)。隨后實驗發現敲除CFL1后HCCLM3和MHCC97h細胞的增殖，遷移和侵襲能力被抑制，表明CFL1促進HCC的增殖，遷移和侵襲。

圖2 CFL1促進HCC的增殖和侵襲

4、CLF1敲除抑制小鼠HCC的生長和肺部轉移

隨后，作者在體內進一步驗證CLF1的功能。結果如圖3所以，敲除CFL1后顯著降低了HCC細胞的腫瘤體積和腫瘤，并減少了肺轉移結節數量。IHC表明CLF1的敲除也導致EMT相關蛋白的抑制。總之，CLF1敲除抑制小鼠HCC的生長和肺部轉移。

圖3 CLF1敲除抑制小鼠HCC的生長和肺部轉移

5、CFL1是HIF-1α在HCC細胞中的下游靶基因

為了闡明低氧對HCC中CFL1表達的影響，將HCCLM3和Hep3B細胞在低氧培養箱中培養48 h。結果發現低氧誘導導致CFL1的表達升高，但是當HIF-1α敲除后，低氧誘導并不能提高CFL1的表達，并且使用HIF-1α的抑制劑處理HCCLM3和Hep3B細胞，也能降低因低氧誘導導致CFL1表達升高（圖4A-F）。ChIP-PCR檢測進一步發現，HIF-1α和HIF-1β與HCC細胞CFL1啟動子中的HRE直接結合（圖4G）。在低氧條件下，轉染HRE熒光素酶質?；?/span>CFL1啟動子-熒光素酶質粒的HEK 293T細胞中熒光素酶報告基因活性升高（圖4H）。

圖4 HIF-1α激活HCC細胞中CFL1的轉錄

接下來，在低氧條件下，在HCCLM3和Hep3B細胞中敲低CFL1的表達（圖5A）。結果表明，CFL1敲除顯著逆轉了缺氧誘導的HCCLM3細胞增殖、細胞遷移和侵襲以及EMT（圖5A-D）。綜上所述，這些結果表明CFL1表達受HIF-1α的轉錄調控，介導缺氧誘導的HCC進展。

圖5 CFL1敲除逆轉了HIF誘導的HCC細胞的增殖和侵襲

6、CFL1通過抑制泛素介導的PLD1降解來維持PLD1的表達

為了進一步探索CFL1在HCC中致癌作用的下游機制，利用KEGG數據庫篩選了受CFL1影響的通路。其中CFL1的高表達與細胞膜中細胞粘附分子和蛋白的定位密切相關（圖6A）。然后，基于蛋白質相互作用數據庫預測了CFL1和PLD1之間的潛在相互作用（圖6B）。CFL1敲低降低了HCCLM3細胞中PLD1的蛋白水平，而CFL1過表達增強了Hep3B細胞中PLD1蛋白表達（圖6C）。co - IP實驗表明，CFL1與PLD1相互作用，敲低CFL1可促進肝癌細胞中PLD1的泛素化(圖6D-E)。用放線菌酮(CHX，2μg/mL)阻斷肝癌細胞蛋白質合成。繪制蛋白降解曲線，表明CFL1敲低時PLD1蛋白降解更快（圖6F）。此外，蛋白酶體抑制劑MG132(25 μM)處理可阻斷CFL1敲低誘導的HCC細胞中PLD1降解（圖6F）。因此，這些結果表明CFL1抑制肝癌細胞中泛素介導的PLD1蛋白水解。

圖6 CFL1調節HCC細胞中PLD1的降解

7、CFL1/PLD1軸介導低氧誘導的HCC細胞中AKT途徑的激活

之前的一項研究表明，PLD1激活AKT及其下游mTOR通路促進HCC細胞增殖、侵襲。與此一致，作者觀察到CFL1敲除降低了p-AKT水平，在HCCLM3細胞中通過PLD1恢復增強了p-AKT水平（圖7A，C）。此外，PLD1沉默逆轉了CFL1誘導的Hep3B細胞中AKT信號轉導通路的活化（圖7B，D）。值得注意的是，CFL1或PLD1敲除抑制了肝癌細胞中缺氧誘導的AKT通路激活和EMT過程（圖7E，F）。之后，進行拯救實驗探討HIF-1α-CFL1-PLD1軸中PLD1的功能。在HCCLM3細胞中過表達的PLD1可以逆轉低氧條件下CFL1-shRNA引起的對AKT磷酸化或EMT過程的抑制（圖7G，H）?？偟膩碚f，證實CFL1/PLD1軸在缺氧誘導的HCC進展中起重要作用。

圖7 CFL1/PLD1軸介導低氧誘導的HCC細胞中AKT途徑的激活

總之，該研究表明HCC中過表達CFL1與較差的臨床病理學參數呈正相關。體外和體內實驗證實CFL1是HCC腫瘤生長和轉移的驅動因素。PDL1/AKT通路介導CFL1的致癌功能。此外，CFL1是一個缺氧反應基因，通過激活PLD1/AKT信號轉導參與缺氧誘導的HCC進展（圖8）。綜上所述，該研究表明CFL1是低氧微環境與HCC進展之間的一種新的連接體。

圖8本研究結果的示意圖

參考文獻：

Yao Bowen., Li Yazhao., Chen Tianxiang., Niu Yongshen., Wang Yufeng., Yang Yuanyuan., Wei Xinyu., Liu Qingguang., Tu Kangsheng.(2021). Hypoxia-induced cofilin 1 promotes hepatocellular carcinoma progression by regulating the PLD1/AKT pathway. Clin Transl Med, 11(3), e366. doi:10.1002/ctm2.366