系統性紅斑狼瘡(SLE)患者大多數存在I型IFN刺激基因(ISGs)的高表達。線粒體異常也有報道，但I型IFN暴露對這些變化的貢獻尚不清楚。此外，I型IFN通過上調脂肪酸氧化(FAO)和氧化磷酸化(OXPHOS)促進漿細胞樣樹突狀細胞（pDCs）的線粒體功能。本文數據表明，I型IFN暴露通過代謝重編程促進CD8 + T細胞死亡，有助于SLE發病。本文于2021年3月發表在《Nature Communications》IF:12.121。

技術路線如下：

主要實驗結果如下：

1、ISGs高表達患者OXPHOS基因下調

為了確定是否T細胞的轉錄組特征可以幫助鑒定SLE患者的疾病活動，作者對來源于激活和未激活女性的CD8⁺ T和CD4⁺ T細胞的mRNA進行測序。對DEGs進行聚類熱圖分析，發現SLE患者根據ISG表達水平被分為顯著的兩類：SLE-1和SLE-2（Fig. 1a, b）。在兩種T細胞中，SLE-2類群的患者具有更強烈的I型IFN特征。在CD4⁺ T細胞中，這種特征伴隨著參與JAK-STAT信號和T細胞共刺激的基因，而在CD8⁺ T細胞中，ISG基因的高表達與基因參與細胞周期，響應DNA損傷和凋亡有關（Fig. 1a, b）。比較SLE-1和SLE-2組的轉錄表達譜，結果顯示，除ISGs外，mtDNA編碼的OXPHOS基因的表達差異最大（Fig. 1c, d）。總之，SLE患者純化T細胞的轉錄組學分析根據ISG表達水平將其分為兩組，表達高I型IFN標記的患者顯示線粒體編碼基因和線粒體相關代謝途徑的表達減少，在CD8 + T細胞中更明顯。這表明SLE中與I型IFN相關的線粒體功能失調。

圖1健康志愿者和SLE患者CD8⁺ T和CD4⁺ T細胞的轉錄組學分析

2、ISGs高表達患者CD8+ T細胞線粒體異常

在研究I型IFN信號與線粒體異常之間的潛在聯系之前，應用計算機模擬和體外相結合的方法，根據I型IFN信號的強弱程度對SLE患者進行分層：高水平的ISGs(IFN-high)、低水平的ISGs(IFN-low)和無ISGs(IFN-Neg)。隨后，探究IFN-high和IFN-Neg的SLE患者中T細胞的線粒體基因型，以類風濕性關節炎（RA）患者為疾病對照。結果發現，與健康組，IFN-Neg組和RA組相比，來源于IFN-high的SLE患者的CD8⁺ T細胞表現出線粒體大小增加（圖2a,b）和線粒體膜超極化（圖2c）。在IFN-High的SLE患者中，也觀察到細胞ROS (cROS)陽性CD8+ T細胞比例增加，但只是線粒體ROS (mROS)染色細胞比例有上升趨勢（圖2d）。在IFN -Neg的SLE患者中也檢測到更高比例cROS陽性細胞，這表明了一種疾病特異性效應（圖2d）。

顯微圖像補充了流式細胞術數據，顯示在來IFN-High的SLE的CD8+ T細胞中，線粒體在形態上與IFN -Neg的SLE患者不同，在IFN-High CD8+ T細胞中，每個細胞的平均線粒體總體積更大(圖2e)。綜上所述，這些數據表明，在SLE患者中，長期暴露IFNα可能會觸發CD8+細胞的線粒體變化，但不會觸發CD4+和T細胞的線粒體變化，這可能導致代謝紊亂的細胞，對其功能具有潛在的影響。

圖2 SLE患者總CD8⁺ T細胞的線粒體變化

3、來自IFN-High的SLE患者的CD8+ T細胞的SRC減少

接下來比較了從SLE患者和HC外周血分選的離體CD4 + 和CD8 + T細胞的線粒體呼吸和有氧糖酵解。使用Seahorse細胞外通量分析儀，發現IFN-Neg患者的CD8 + T細胞具有與HC相似的基礎和最大耗氧量率(OCR)，而IFN-High患者的CD8 + T細胞表現出較少的基礎和最大OCR（圖3a）。重要的是，在IFN-High CD8 + T細胞中，備用呼吸能力(SRC)，反映細胞適應能量需求增加的能力，顯著降低（圖3a）。SRC的降低伴隨著細胞內ATP水平的一些降低（附圖9a）。另一方面，從相同患者中同時分離的CD4 + T細胞中未檢測到OCR或SRC的顯著異常（圖3a）。接下來探索在IFN-High患者的CD8 + T細胞離體觀察到的代謝異常是否會導致T細胞缺陷。與健康對照和IFN-Neg SLE患者相比，IFN-High SLE患者的CD8 + T細胞自發死亡增加（圖3b）。總的來說，數據表明，I型IFN通路的持續激活可能會降低CD8 + T細胞的代謝適合性，從而降低其存活能力。

圖3 SLE患者CD8⁺T細胞的代謝分析和凋亡率

4、TCR和IFN信號共同誘導CD8+ T細胞代謝重組

為了研究導致IFN-High CD8 ⁺ T細胞線粒體和代謝變化的連續事件，接下來使用來源于健康對照和結合了延長IFN處理和TCR活化（這是SLE患者中存在的兩種基本細胞信號）的細胞。盡管CD8 + T細胞暴露于IFNα 里2天不會引發任何顯著的線粒體或代謝變化但7天IFNα暴露，尤其是結合T細胞活化，可誘導mtDNA編碼基因表達下調（圖4a）和線粒體變化（圖4b）。然后，分析了CD8 + T細胞的氧化能力，發現在有或沒有CD3/CD28活化的情況下，7天IFNα刺激顯著增強了基礎OCR，但沒有最大OCR，當數值標準化到每個樣本的基礎水平時，導致SRC降低，尤其是當IFNα暴露與T細胞活化結合時（圖4c）。

IFNα和抗CD3/CD28磁珠長期刺激后CD8 + T細胞中SRC能力的降低表明生物能量適應性受損。研究發現，IFNα刺激的CD8 + T細胞在初始爆發后，與僅用CD3/CD28刺激的CD8 + T細胞相比，其氧化和糖酵解能力下降更快（圖4d）。總之，使用健康對照CD8 ⁺ T細胞的體外研究表明，雖然單獨延長IFNα處理能夠觸發可檢測的代謝改變，但只有IFNα暴露和T細胞活化的聯合才能表型復制IFN-High SLE患者CD8 + T細胞中觀察到的線粒體和代謝異常。

圖4. 7天內IFNα暴露和T細胞活化引發的代謝變化

5、IFNα暴露誘導慢性激活CD8+ T細胞死亡

在建立重現SLE CD8 + T細胞代謝變化的實驗條件后，接下來研究了下游效應。與SLE患者的離體數據一致，發現IFNα暴露延長聯合T細胞活化可促進CD8 + T細胞的自發死亡（圖5a）。與自發性細胞死亡數據一致，作者發現再激發后，暴露于IFNα的細胞中表達Annexin V的增殖性CD8 + T細胞百分比顯著增加（圖5b）。此外，在IFN刺激的細胞中檢測到較少的脫顆粒（CD107a陽性）和活化的（CD69和CD25陽性）CD8 + T細胞（圖5c）。總之，數據表明，I型IFN改變了SLE患者CD8⁺ T細胞的代謝，導致TCR再激發后細胞存活率降低。

圖5. IFNα暴露7天誘導T細胞活化的變化

6、IFNα暴露增加CD8⁺ T細胞的NAD+的消耗

為了了解慢性I型IFN與CD8 + T細胞下游線粒體和代謝變化之間的機制聯系，首先在SLE患者CD8 + T細胞的轉錄組學數據中探索了哪些通路與I型IFN信號相關。結果顯示煙酸/煙酰胺代謝途徑顯示出最高的相關性（圖6a），并且在IFN-high SLE患者的CD8 + T細胞中，NAD消耗酶，如ADP-核糖聚合酶（PARP9、PARP10和PARP12）和CD3828顯著上調（圖6b）。觀察到延長IFNα和TCR刺激后CD8⁺T細胞中NAD +/NADH比值顯著降低（圖6d），該實驗條件模擬了在IFN-high的SLE患者CD8 + T細胞中觀察到的線粒體和代謝異常，表明在活化的CD8 + T細胞中，I型IFN信號引起的NAD消耗酶表達上調可導致NAD + 耗竭和隨后的線粒體功能障礙。

為了檢測補充NAD ⁺ 是否可以糾正IFNα刺激的下游效應，用1 mM β-煙酰胺單核苷酸(NMN)培養CD8 + T細胞以恢復NAD +/NADH比值（圖6e）。然后，評估了用抗CD3/CD28再刺激后的氧化反應和細胞活力。補充NMN的NAD + 增加了OCR（圖6f），但未增加ECAR，表明線粒體能力增加。重要的是，通過NMN處理恢復NAD + 的可用性改善了IFNα延長和TCR刺激后的細胞活力（圖6 g），表明NAD途徑調節這些活化的人CD8 + T細胞中的線粒體適應性和細胞存活率。總之，這些數據表明，在人TCR刺激的CD8 + T細胞中，延長IFNα暴露增加了NAD + 的消耗，并降低了NAD +/NADH比值。這導致再刺激后線粒體呼吸缺陷和細胞活力降低。NAD + 前體NMN糾正了這些代謝變化，提高了CD8 + T細胞活力。

圖6. IFNα增加NAD+消耗導致SCR降低和細胞活力

本文在一組臨床定義明確的SLE伴活檢證實的腎炎患者中進行的T細胞轉錄組學和代謝研究表明，高IFN信號可驅動CD8 + T細胞線粒體代謝途徑的變化，使其生物能量不適應且更容易死亡。本文證明在SLE患者的CD8 + T細胞中觀察到的代謝重編程是延長IFNα暴露和TCR刺激的結果。在這兩種刺激的持續組合下，這可能是SLE患者特有的一種情況，CD8 + T細胞表現出與NAD + 消耗增強、線粒體氧化能力降低和存活率下降相關的PARP基因表達增加（圖7)。總的來說，本文的發現證明高ISG特征與SLE CD8 + T細胞的代謝適合性之間的聯系，以及它們在壓力下或對抗原再激發的反應中存活的能力。

圖7. I型干擾素調節SLE患者CD8⁺T細胞的代謝適合度

參考文獻：

Buang Norzawani., Tapeng Lunnathaya., Gray Victor., Sardini Alessandro., Whilding Chad., Lightstone Liz., Cairns Thomas D., Pickering Matthew C., Behmoaras Jacques., Ling Guang Sheng., Botto Marina.(2021). Type I interferons affect the metabolic fitness of CD8 T cells from patients with systemic lupus erythematosus. Nat Commun, 12(1), 1980. doi:10.1038/s41467-021-22312-y