脊髓損傷（Spinal cord injury, SCI）患者表現出腸道菌群紊亂，而腸道失調加重SCI模型中的神經損傷。大量數據支持腸道微生物組在SCI中發揮重要作用。本文作者推測：來源于健康未損傷小鼠的糞便微生物移植至SCI小鼠可以發揮神經保護作用改善SCI。本研究于2021年3月發表在《Microbiome》IF: 11.607期刊。

技術路線：

本文主要實驗結果如下：

1.      FMT處理可以改善脊髓損傷小鼠的運動恢復

為了探究腸道微生物群對SCI的影響，將健康未損傷小鼠來源的FMT轉移至SCI損傷小鼠中（圖1a）。在用抗生素取出微生物后，小鼠隨機分為4組：sham, sham+FMT, SCI, SCI+FMT。結果表明，與SCI組比較，在FMT處理14天后即顯著提高了后肢的運動功能，并且提高了開放運動（BMS）得分和BMS亞得分（圖1b, c）；FMT處理后站立階段的行走時間百分比顯著減少(圖1d)。此外，步幅長度增加，步幅頻率降低，而FMT處理逆轉了這一趨勢(圖1e, f)。FMT能在一定程度上改善脊髓損傷所致的步態異常，增強步態的協調性。SCI小鼠的握力在損傷后逐漸持續恢復。損傷后7天，14天，和21天，SCI組與FMT組的握力無明顯差異。僅在損傷后28 天時，與SCI組相比，FMT組表現出了具有統計學意義的改善(圖1g)。總之，與未接受FMT治療的受傷小鼠相比，接受FMT治療的小鼠表現出相對更大的運動恢復。

圖1 FMT治療對運動恢復的影響

2. FMT處理可以促進下行運動通路的恢復

隨后，為了檢測運動皮質到后肢運動神經元的下行通路的功能，在傷后4周記錄了運動誘發電位(MEPs)（圖2）。MEPs，反應神經肌肉單元連通性的，電刺激運動皮層后，記錄腸道肌肉的MEPs（圖2a）。在Sham組和Sham+FMT組，檢測到典型的MEPs波形。受傷后，MEPs大多被消除，表明神經肌肉單元的破壞。與未使用FMT治療的SCI小鼠相比，使用FMT治療的SCI小鼠表現出更大的振幅(圖2b)。不同組的振幅量化如圖2c所示。此外，SCI小鼠MEP潛伏期(至17.8 ms)明顯高于Sham組(4.63 ms)。SCI與SCI+FMT組MEP潛伏期無顯著差異(圖2d)。這些觀察結果表明，FMT治療是有益的，并可能進一步促進脊髓損傷后的功能恢復。

圖2 FMT治療對脊髓傳導能力的影響

3. FMT處理促進神經元存活和突觸重建

為了探究所觀察到的運動恢復的解剖學基礎，我們對脊髓切片進行免疫熒光染色（圖3）。在sham組，前角神經元表現正常，胞體大，軸突完整。SCI導致NeuN陽性神經元顯著喪失。然而，與SCI組相比，FMT組的Neun陽性細胞數量顯著增加(圖3a, b)。突觸蛋白(SYN)是一種標記突觸前膜的囊泡蛋白。免疫染色分析顯示損傷后4周SCI組突觸蛋白染色降低，經FMT處理后突觸蛋白染色強度增加(圖3 b, d)。神經絲(NF-200)是神經元軸突中富含的細胞特異性蛋白，其染色已被應用于評估神經元和軸突損傷。與SCI組相比，損傷后4周，FMT處理后病變區NF-200染色增加(圖3b, e)。數據表明，FMT處理可能促進了創傷性脊髓損傷后神經元的存活和軸突再生。

圖4 FMT治療對脊髓損傷后神經元存活和突觸再生的影響

4. FMT處理可以改善SCI小鼠的體重增加和代謝狀況

在指定的時間點監測并比較體重。與SCI組相比，SCI + FMT組體重增加更多，在術后14，21，和28天均表現出顯著差異（圖4a）。與這些結果相一致的是，與SCI組比較，在SCI +FMT組中觀察到食物攝入量和水消耗量的增加，特別是在損傷后第28天(圖4b, c)。間接量熱法測定平均呼吸交換商（RQ值）在SCI + FMT組恢復正常(圖4 d, e)。如圖4f, g所示，在脊髓損傷動物中，FMT治療也顯著提高了平均能量消耗。這些結果證實SCI后的FMT處理導致更多食物和水的消耗，更高的能力消耗，和更大的體重增加。

圖4 FMT治療對體重、食物攝入、水消耗和新陳代謝的影響

5. FMT處理有利于維持SCI小鼠腸道屏障的完整性

改變腸道屏障完整性和隨后的胃腸道功能障礙被認為是SCI的病理生理事件。為了測試是否FMT處理對脊髓損傷后小鼠腸道屏障通透性有影響，在損傷后第4周測定FITC標記的葡聚糖(4kd)和血液中FITC水平。與SCI + FMT小鼠相比，SCI小鼠結腸通透性更嚴重(圖5a)。腸道緊密連接已被證明與腸道屏障完整性有關。如圖5b、c所示，ZO-1和occludin表明結腸表面的破壞和無序增加，FMT治療穩定了緊密連接結構，這可以從ZO-1和occludin的平滑和有組織定位得到證明(圖5b)。結果表明，FMT處理導致緊密連接蛋白表達上調并促進SCI后的腸道屏障完整性的維持。

圖5 FMT處理對腸通透性和緊密連接蛋白表達的影響

6. FMT處理加速SCI小鼠的胃腸道消化

胃腸道消化，是整體評估腸道活力的，用鋇劑灌胃后再用x射線成像對小鼠進行評估。不同組在不同時間點的代表性圖像如圖6a所示(2、3、8 h)?？偟膩碚f，SCI小鼠表現出更高水平的胃腸道充盈，表明胃腸道運輸較慢，而FMT處理加速了小鼠損傷后胃腸道轉運(圖6a)。在結腸充盈和活力方面，在SCI后顯著降低，但在某些時間點在SCI + FMT組得到改善(圖6 a, b)。形態學分析表明，SCI損傷導致結腸填充增加，但被FMT處理逆轉(圖6 a、c)?？偟膩碚f，FMT處理可能導致SCI后胃腸道消化活力變快。

圖6 FMT對SCI小鼠胃腸運動的影響

7. FMT處理調節SCI小鼠的腸道微生物組成

為了檢測FMT是否調節腸道微生物組，進行了16S rDNA測序以分析微生物治療SCI小鼠后的細菌分類組成。如圖7a、b所示，sham組與SCI組的ace、chao指數存在顯著差異，說明SCI對抗生素治療后的再定殖過程中微生物群的豐富度有顯著影響，這一觀察結果與我們之前發表的脊髓損傷患者與健康對照組的臨床數據一致。FMT處理顯著增加了SCI小鼠腸道菌群的豐富度。熱圖顯示，在門水平上，各組的相對豐度存在顯著差異(圖7c)。與Sham組相比，SCI組Firmicutes厚壁菌門相對豐度降低，而FMT處理逆轉了這一趨勢。相比之下，在SCI小鼠中擬桿菌門的相對豐度與SCI小鼠沒有差異(圖7c)。ANCOM模型對每個分類單元的分析表明SCI處理顯著降低了Firmicutes門的Christensenellaceae and Lactobacillus的豐度；FMT處理顯著增加了Christensenellaceae的豐度，但是對Lactobacillus的影響很小（圖7d）。Bacteroidetes門的Butyricimonas, Muribaculaceae, and Bacteroides的豐度在sham組和SCI組間顯著改變；FMT處理顯著增加了SCI小鼠的Butyricimonas的豐度（圖7d）。總之，這些結果表明FMT處理可以調節SCI小鼠的微生物群組成以改善腸道微生物失調。

圖7 FMT處理對脊髓損傷后腸道細菌組成的影響

8. FMT處理可恢復SCI小鼠中糞便短鏈脂肪酸(SCFAs)

腸道微生物發酵的某些最終產物可進入血液，影響宿主中樞神經系統的生理功能。在調控微生物群系腸-腦軸的潛在因子中，微生物代謝產物短鏈脂肪酸（SCFAs）可能是主要的中介因子。檢測了不同組糞便中乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和己酸等短鏈脂肪酸的濃度。檢測的糞便短鏈脂肪酸中，丁酸含量變化最大， SCI組與sham組比較減少了58.6%。與SCI小鼠相比，FMT上調了糞便丁酸水平46.7%(圖8b)。與丁酸類似，與sham組比較，SCI小鼠體內丙酸和異丁酸含量也分別下降了21.2%和39.4%，而FMT處理后，SCI小鼠糞便丙酸和異丁酸水平分別顯著提高了21.3%和65.0%(圖8a、c)。SCI小鼠的己酸減少了31.8%，但FMT治療并沒有顯著改變己酸的數量(圖8d)。此外，沒有發現乙酸、戊酸和異戊酸的顯著變化(表S1)。這些數據表明，FMT治療可能通過改變糞便短鏈脂肪酸介導宿主的病理生理變化。

圖8 FMT治療對小鼠糞便短鏈脂肪酸水平的影響

9. 短鏈脂肪酸與運動恢復/腸屏障通透性的相關性

接下來，評估了丙酸、丁酸和異丁酸的含量是否與運動恢復或腸道完整性相關。多變量方差分析(MANOVA)以各組為自變量，運動預后(BMS評分和BMS亞得分)、腸道滲透率(FITC -葡聚糖)和代謝產物水平(丁酸、丙酸和異丁酸)為因變量。如圖9所示，丙酸含量與BMS得分及BMS亞得分呈正相關；丁酸數量與BMS分數和BMS子分數的相關性也得到了類似的結果。丁酸含量與熒光素標記葡聚糖的滲透性呈負相關關系。此外，異丁酸含量與BMS得分呈正相關。異丁酸含量與BMS評分/ FITC -葡聚糖滲透性之間的相關性無統計學意義。因此，某些短鏈脂肪酸的含量對SCI后的功能恢復和屏障完整性具有一定的預測能力。

圖9 SCFAs與BMS評分/BMS亞評分/ FITC -葡聚糖通透性之間的相關性

10. FMT可能通過抑制IL-1β/ NF-κB信號通路來緩解神經炎癥

為了進一步探討SCI腸道微生物失調與神經炎癥之間的分子相互作用，應用免疫組化和WB分析了TNFα、IL-1β和NF-κB的在脊髓中的表達(圖10a, b)。從圖10c可以看出，TNFα的表達在不同組間無明顯變化。同時，脊髓損傷4周后，小鼠脊髓組織中IL-1β和NF-κ b陽性表達顯著增加。此外，FMT治療降低IL-1β和NF-κB陽性染色（圖10a）。WB結果顯示，FMT處理明顯降低了損傷后IL-1β和NF-κB的表達(圖10d, e)，而對TNFα的表達無明顯改變(圖10c)，這與免疫染色結果一致。

圖10 FMT治療對脊髓TNF α、IL-1β、NF-κB表達的影響

11. FMT可能通過抑制NF -κB信號通路來緩解腸道炎癥

作者還調查了炎癥是否與腸道有關。免疫組織學染色顯示TNFα、IL-1β和NF- κ b陽性染色主要分布在結腸黏膜層。WB結果顯示，結腸中炎癥分子的相對表達似乎低于脊髓中的。圖11顯示，組織染色(圖11a)和WB(圖11b-d)顯示，TNFα和IL-1β的表達在各組間無顯著差異，然而，與sham組比較，SCI小鼠結腸中NF -κB的表達上調，SCI + FMT組的小鼠表現出NF –κB表達下調，與SCI組相比(圖11 a, b, e)。這些結果表明，NF -κB信號通路參與腸道炎癥和神經炎癥。最近的研究表明，短鏈脂肪酸在神經退行性疾病中發揮抗炎和神經保護作用。FMT可能改變SCFA表達譜，減輕腸道炎癥和神經炎癥。

圖11 FMT治療對結腸TNF α、IL-1β、NF-κB表達的影響

結論：

FMT治療促進了小鼠脊髓功能恢復，促進了神經元軸突再生，改善了動物體重增加和代謝特征，并增強了腸道屏障完整性和胃腸道運動。此外，FMT處理顯著改變了腸道菌群組成和糞便短鏈脂肪酸的數量。此外，FMT還下調了脊髓IL-1β/NFκb信號通路和腸道NF-κB信號通路。這些數據表明，FMT對腸道菌群的重編程改善了SCI小鼠的運動功能和腸道功能，可能是通過短鏈脂肪酸的抗炎作用。