circRNAs是一類非編碼RNAs，可通過與miRNA結合調節基因表達；此外，circRNAs已經被證明參與了幾個病理過程。然而circCUL2在胃癌(GC)中的表達及生物學功能尚不清楚。那么小編為大家帶來近期發表于影響因子15.302的“Molecular Cancer”上的文章“circCUL2 regulates gastric cancer malignant transformation and cisplatin resistance by modulating autophagy activation via miR-142-3p/ROCK2”，為大家詳細介紹circCUL2在胃癌中的作用和具體分子機制。

我們發現circCUL2在GC組織和細胞系中下調。circCUL2抑制GC細胞的增殖、遷移和侵襲。此外，circCUL2在耐順鉑GC細胞系中下調，并調節了順鉑的敏感性。circCUL2可能通過競爭性結合miR-142-3p、調節ROCK2表達和自噬激活，參與腫瘤發生和化療耐藥性。

技術路線：

結果：

1）  circCUL2在GC組織和細胞中的表達和特征

我們應用芯片技術來探索幾種circRNAs在胃癌組織和鄰近組織之間的差異表達。基于差異表達的基因以及GO和KEGG分析結果，我們選擇circCUL2進行進一步研究。與成對的非癌組織相比，胃癌組織中circCUL2的表達明顯降低(圖1a)。通過ROC分析circCUL2對GC的診斷價值，ROC曲線下面積為0.790 (圖1b)。Kaplan-Meier分析顯示circCUL2水平低的胃癌患者總生存率較差(圖1c)。然后，通過qRT-PCR檢測，與正常血清相比，GC血清中circCUL2水平明顯降低(圖1d)。此外，AGS和SGC-7901細胞株中的circCUL2水平降低，選擇進行進一步研究(圖1e)。

隨后，我們通過Sanger測序對circCUL2 qRT-PCR產物序列進行了驗證，靶區為頭尾剪接位點，序列與circBase數據庫中的序列一致(圖1f)。circCUL2可以抵抗RNase R的處理(圖1g-i)，聚合引物擴增的線性CUL2被RNase R消化(圖1g-i)。此外，在經轉錄抑制劑放線菌素D處理的AGS和SGC-7901細胞系中，CUL2的線性轉錄本的半衰期比circCUL2短(圖1j)。核質RNA qRTPCR和FISH抗circCUL2的結果顯示，circCUL2優先定位于細胞質中(圖k-l)。這些結果表明circCUL2可能參與了GC的發生發展，circCUL2穩定且主要分布在細胞質中。

2）  circCUL2抑制GC細胞的惡性轉化

為了進一步探究circCUL2對GC細胞的功能作用，我么利用RNA干擾和過表達質粒進行以下實驗(圖2a)。CCK-8和EdU實驗證實circCUL2下調增強了GC細胞的增殖能力(圖2b-c)。circCUL2抑制也增強了對菌落形成的影響(圖2d)。此外，通過Transwell和傷口愈合檢測細胞遷移，發現circCUL2特異性siRNA增加了細胞遷移(圖2e和f)。在circCUL2過表達的細胞中，細胞浸潤被抑制，而在circCUL2表達降低的細胞中，細胞浸潤被促進(圖2f)。過表達circCUL2則產生相反的效果，它抑制了細胞的增殖、遷移和侵襲(圖2b-f)。

3）  circCUL2作為miR-142-3p海綿

circCUL2的細胞質定位提示circCUL2可能在轉錄后水平參與了GC的發展。為了研究選擇性剪接機制，我們檢測了CUL2在GC組織中的線性表達。qRT-PCR結果顯示CUL2在GC組織中升高，但與circCUL2無相關性(圖3a-b)。此外，抑制或過表達circCUL2均不會改變線性CUL2的mRNA表達水平(圖3c)。在排除了選擇性剪接機制后，我們下一步研究了circCUL2結合miRNAs的能力。CircInteractome和circRNABase工具用于預測可能與circCUL2序列結合的潛在靶標miRNAs(圖3d)。結合GC組織的miRNA芯片(圖3e)，選擇miR-142-3p和miR-653。在circCUL2 siRNA或circCUL2過表達質粒處理的細胞中，只有miR-142-3p水平升高或降低(圖3f)。然后，利用NCBI數據庫進行功能分析，篩選出miRanda、miRBridge、PicTar、PITA和TargetScan預測的miR-142-3p的靶基因(圖3g)。只有ROCK2被發現受到circCUL2和miR-142-3p的調控(圖3h)?；谶@些結果，我們推測circCUL2可能作為miR142-3p海綿調節ROCK2。

4）  體內circCUL2、miR-142-3p和ROCK2的表達

為了研究circCUL2、miR-142-3p和ROCK2在體內的作用，我們對circCUL2和miR-142-3p在GC組織中的作用進行了FISH檢測。結果顯示，circCUL2和miR-142-3p共局域化，表達相反(圖4a)。在GC組織中，miR142-3p的miRNA水平顯著上調(圖4b)，而ROCK2的mRNA和蛋白水平顯著降低(圖4c-d)。此外，miR-142-3p與circCUL2或ROCK2表達水平呈顯著負相關，而circCUL2和ROCK2表達水平呈顯著正相關(圖4e-g)。接著，將穩定轉染circCUL2OE或空載體的細胞皮下接種于裸鼠，密切監測裸鼠腫瘤生長4周。我們的結果表明，來自circCUL2-OE細胞的腫瘤明顯小于來自空載體-的腫瘤轉染細胞(圖4h)的體積和重量(圖4i-j)?；贔ISH(圖4k)觀察了circCUL2和miR-142-3p的共定位。

5）  circCUL2在體外通過miR-142-3p/ROCK2調控惡性轉化

在體外我們進一步研究了circCUL2/miR-142-3p/ROCK2是否能夠調控腫瘤的發生和惡性轉化。生物信息學數據庫分析預測circCUL2和ROCK2可以與miR-142-3p結合(圖5a)。熒光素酶報告基因實驗結果進一步證實，miR-142-3p可以直接結合circCUL2和ROCK2的3'UTR位點(圖5b)。RNA下拉結果顯示，與對照組相比，circCUL2特異性探針下拉樣品中circCUL2和miR-142-3p顯著富集(圖5c)。接下來，我們在AGS和SGC-7901細胞系中使用抗AGO2抗體進行RIP。結果顯示circCUL2和miR-142-3p被抗AGO2抗體沉淀后顯著富集(圖5d)。此外，我們還探討了circCUL2/miR-142-3p調控GC進展的潛在機制。miR-142-3p模擬物或circCUL2 siRNA誘導的ROCK2 mRNA和蛋白水平下降，分別通過過表達circCUL2或轉染miR-142-3p抑制劑逆轉(圖5e和f)。此外，在AGS和SGC-7901細胞中過表達miR-142-3p可提高增殖率(圖5gh)、遷移能力和侵襲能力(圖5j-k)。為了進一步確定circCUL2是否通過與miR-142-3p相互作用發揮其功能，我們將miR-142-3p模擬物和circCUL2表達質粒共轉染到GC細胞中。過表達circCUL2的細胞中，miR-142-3p對GC細胞生長和運動促進的影響被逆轉(圖5g-k)。這些數據表明circCUL2通過吸附miR-142-3p抑制GC細胞的生長和轉移。

6）  circCUL2調節胃癌細胞對順鉑的敏感性

由于circCUL2下游的miR-142-3p和ROCK2可能與胃癌預后相關，我們分析了TCGA數據庫，發現miR-142-3p的高表達和ROCK2的低表達可導致無病生存(DFS)或DFS聯合化療縮短(圖6a-b)。提示circCUL2可能參與了GC細胞的化療耐藥性。因此，我們篩選順鉑、5-FU、DOX和MMC，以確定circCUL2對其敏感性影響最大的藥物。結果顯示，升高的circCUL2主要抑制順鉑處理的細胞活力，而降低的circCUL2主要誘導順鉑耐藥(圖6c)。干擾circCUL2可以提高IC50，而過表達circCUL2可以降低IC50(圖6d)。

為了驗證circCUL2調控順鉑敏感性的假設，我們構建了順鉑耐藥AGS/DDP和SGC-7901/DDP細胞系。與正常GC細胞系相比，順鉑耐藥GC細胞系circCUL2和ROCK2表達顯著降低，miR142-3p表達顯著升高(圖6e)。隨后，共轉染miR-142-3p模擬物和circCUL2表達構建物后，順鉑處理AGS/DDP和SGC-7901/DDP細胞系。當細胞過表達miR-142-3p時，circCUL2誘導的增殖抑制和凋亡促進作用被逆轉(圖6f-i)。此外，異種移植瘤數據顯示，高水平的circCUL2顯著降低了異種移植瘤的生長，并使細胞對順鉑治療敏感(圖6j-k)。qRT-PCR結果顯示，circCUL2的上調可顯著誘導circCUL2和ROCK2的mRNA水平，而異種移植標本中miR-142-3p的水平則受到抑制(圖6l)。這些數據表明，過表達的circCUL2通過吸附miR-142-3p促進順鉑的敏感性。

7）  circCUL2通過靶向順鉑耐藥GC細胞中的miR-142-3p抑制自噬

自噬與miR-142-3p和ROCK2的差異表達相關。circCUL2提高了順鉑在GC中的敏感性，因此我們有興趣研究circCUL2是否通過miR-142-3p在AGS/ DDP和SGC-7901/DDP細胞系中抑制自噬。與預期一樣，WB分析顯示，過表達circCUL2增加了ROCK2和p62的表達，而miR-142-3p模擬物則挽救了它們(圖7a)。此外，circCUL2抑制了自噬活性的標記物LC3和Beclin1的表達，但在順鉑耐藥的GC細胞中過表達miR-142-3p時，這種作用被逆轉(圖7a)。與模擬細胞相比，外源GFPLC3B質粒預處理后的DDP處理細胞中，GFP-LC3B斑點顯著增加，表明自噬小泡形成(圖7b)。此外，過表達circCUL2的細胞自噬小泡的形成比載體處理的細胞少。自噬小泡形成的減少可以被miR-142-3p模擬物逆轉(圖7b)。同樣，免疫熒光法計算的LC3蛋白表達量(圖7c)和透射電鏡觀察的自噬小體數(圖7d)與GFP-LC3B質粒轉染結果的趨勢相同。因此，這些結果表明circCUL2通過miR-142-3p/ROCK2在順鉑耐藥GC細胞中抑制自噬。

結論：circCUL2可能通過miR-142-3p/ROCK2介導的自噬激活作為腫瘤抑制因子和順鉑敏感性調控因子，可能是胃癌的關鍵機制和治療靶點。