熱點大碰撞：缺氧腫瘤干細胞-外泌體-lncRNA
欄目：最新研究動態(tài)
發(fā)布時間：2021-03-02
導(dǎo)語：膠質(zhì)瘤干細胞（GSC）是膠質(zhì)瘤中具有特殊增殖和分化能力的腫瘤細胞亞群，是腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因之一，尤其在低氧條件下。外泌體是......
導(dǎo)語：膠質(zhì)瘤干細胞（GSC）是膠質(zhì)瘤中具有特殊增殖和分化能力的腫瘤細胞亞群，是腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因之一，尤其在低氧條件下。外泌體是一種脂質(zhì)膜囊泡，含有蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)，介導(dǎo)細胞間通訊。長鏈非編碼RNA（lncRNA）參與眾多生物學(xué)過程，但其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用仍知之甚少。缺氧GSC、外泌體及l(fā)ncRNA這些熱點碰撞出怎樣的火花，我們先睹為快。
參考文獻：Li, J., et al., Hypoxic glioma stem cell-derived exosomes containing Linc01060 promote progression of glioma by regulating the MZF1/c-Myc/HIF-1α. Cancer research, 2020. (IF=9.727)
參考文獻：Li, J., et al., Hypoxic glioma stem cell-derived exosomes containing Linc01060 promote progression of glioma by regulating the MZF1/c-Myc/HIF-1α. Cancer research, 2020. (IF=9.727)
技術(shù)路線：
結(jié)果：
1. GSCs分泌的Linc01060轉(zhuǎn)移到膠質(zhì)瘤細胞
從人膠質(zhì)母細胞瘤GBM手術(shù)標本中分離原代腫瘤細胞和膠質(zhì)瘤干細胞，流式細胞術(shù)和球體形成實驗進行鑒定。在正常或缺氧條件下培養(yǎng)GSCs，分別形成常氧(N-GSCs)和缺氧(H-GSCs)細胞。GBM、N-GSCs和H-GSCs的條件培養(yǎng)基處理膠質(zhì)瘤U-87細胞時，發(fā)現(xiàn)GSCs的培養(yǎng)基顯著促進細胞增殖、遷移和侵襲，尤其是H-GSCs。
為鑒定GSCs中潛在的外泌體相關(guān)lncRNA，使用有或無缺氧的GSCs外泌體和相應(yīng)的GBM原代細胞進行l(wèi)ncRNA測序。鑒定出Linc01060是聚類中評分最高的非編碼RNA之一。從GSCs的培養(yǎng)基中提取外泌體，透射電子顯微鏡(TEM)、納米顆粒追蹤分析(NTA)和蛋白質(zhì)印跡法(WB)鑒定其形態(tài)、大小和表面標記物。觀察到缺氧促進了外泌體的釋放。
單獨用RNase A處理GSCs時，條件培養(yǎng)基中Linc01060水平?jīng)]變化；但用RNase A和Triton X-100聯(lián)合處理時，其水平顯著降低。同時，外泌體中Linc01060的水平與條件培養(yǎng)基中相似。說明外泌體是細胞外Linc01060的主要載體。Linc01060在6種膠質(zhì)瘤細胞系中明顯上調(diào)，GSCs中Linc01060的過表達或敲低分別導(dǎo)致外泌體Linc01060的上調(diào)或下調(diào)。FISH分析證明Linc01060主要位于細胞質(zhì)，免疫熒光(IF)結(jié)果顯示細胞有效地吸收外泌體。這些結(jié)果表明GSC分泌的Linc01060可通過外泌體轉(zhuǎn)移到膠質(zhì)瘤細胞。
為鑒定GSCs中潛在的外泌體相關(guān)lncRNA，使用有或無缺氧的GSCs外泌體和相應(yīng)的GBM原代細胞進行l(wèi)ncRNA測序。鑒定出Linc01060是聚類中評分最高的非編碼RNA之一。從GSCs的培養(yǎng)基中提取外泌體，透射電子顯微鏡(TEM)、納米顆粒追蹤分析(NTA)和蛋白質(zhì)印跡法(WB)鑒定其形態(tài)、大小和表面標記物。觀察到缺氧促進了外泌體的釋放。
單獨用RNase A處理GSCs時，條件培養(yǎng)基中Linc01060水平?jīng)]變化；但用RNase A和Triton X-100聯(lián)合處理時，其水平顯著降低。同時，外泌體中Linc01060的水平與條件培養(yǎng)基中相似。說明外泌體是細胞外Linc01060的主要載體。Linc01060在6種膠質(zhì)瘤細胞系中明顯上調(diào)，GSCs中Linc01060的過表達或敲低分別導(dǎo)致外泌體Linc01060的上調(diào)或下調(diào)。FISH分析證明Linc01060主要位于細胞質(zhì)，免疫熒光(IF)結(jié)果顯示細胞有效地吸收外泌體。這些結(jié)果表明GSC分泌的Linc01060可通過外泌體轉(zhuǎn)移到膠質(zhì)瘤細胞。
2. GSC來源的外泌體Linc01060促進膠質(zhì)瘤的進展
為闡明外泌體介導(dǎo)的Linc01060的生物學(xué)功能，EdU細胞增殖實驗、克隆形成實驗、transwell遷移和侵襲實驗以及動物實驗驗證GSC來源的外泌體可以加速腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，敲低Linc01060，外泌體不促進這些過程。
3. Linc01060結(jié)合并穩(wěn)定MZF1蛋白
細胞質(zhì)lncRNA在翻譯或翻譯后過程中發(fā)揮調(diào)控作用。利用RNA pull-down和質(zhì)譜分析篩選Linc01060相互作用蛋白，重點研究RNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子髓樣鋅指1(MZF1)。RIP、pull-down試驗證明MZF1與Linc01060的特異性結(jié)合。為驗證Linc01060內(nèi)與MZF1結(jié)合的特定區(qū)域，創(chuàng)建了Linc01060的四個截斷片段，發(fā)現(xiàn)MZF1特異性結(jié)合序列位于Linc01060基因的281-481nt長區(qū)域。
觀察到Linc01060水平的改變調(diào)節(jié)了MZF1蛋白水平，在Linc01060敲除或過表達的細胞中，MZF1 mRNA水平?jīng)]有顯著差異。因此，推測Linc01060可能穩(wěn)定MZF1蛋白。蛋白酶體抑制劑MG-132可挽救Linc01060下調(diào)導(dǎo)致MZF1蛋白水平下降的現(xiàn)象，cycloheximi追蹤試驗顯示，MZF1在Linc01060下調(diào)的細胞中具有較短的半衰期；在過表達Linc01060的細胞中具有較長的半衰期。這表明Linc01060可能通過抑制其蛋白酶體介導(dǎo)的降解來調(diào)節(jié)MZF1。用體外泛素化實驗探索Linc01060是否與泛素介導(dǎo)的MZF1降解有關(guān)。Linc01060的敲低增強了U-87 細胞和U-251細胞中MZF1蛋白的泛素化。相反，在Linc01060過表達的細胞中，泛素介導(dǎo)的MZF1降解明顯減少。這些結(jié)果表明Linc01060穩(wěn)定了MZF1蛋白，并保護其免受泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解。
觀察到Linc01060水平的改變調(diào)節(jié)了MZF1蛋白水平，在Linc01060敲除或過表達的細胞中，MZF1 mRNA水平?jīng)]有顯著差異。因此，推測Linc01060可能穩(wěn)定MZF1蛋白。蛋白酶體抑制劑MG-132可挽救Linc01060下調(diào)導(dǎo)致MZF1蛋白水平下降的現(xiàn)象，cycloheximi追蹤試驗顯示，MZF1在Linc01060下調(diào)的細胞中具有較短的半衰期；在過表達Linc01060的細胞中具有較長的半衰期。這表明Linc01060可能通過抑制其蛋白酶體介導(dǎo)的降解來調(diào)節(jié)MZF1。用體外泛素化實驗探索Linc01060是否與泛素介導(dǎo)的MZF1降解有關(guān)。Linc01060的敲低增強了U-87 細胞和U-251細胞中MZF1蛋白的泛素化。相反，在Linc01060過表達的細胞中，泛素介導(dǎo)的MZF1降解明顯減少。這些結(jié)果表明Linc01060穩(wěn)定了MZF1蛋白，并保護其免受泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解。
4. Linc01060加速MZF1的核轉(zhuǎn)位，促進MZF1介導(dǎo)的c-Myc反式激活
免疫熒光發(fā)現(xiàn)Linc01060可調(diào)節(jié)MZF1的總水平和核水平。MZF1主要定位于細胞質(zhì)，少量存在于細胞核中。在Linc01060敲低細胞中，MZF1在細胞核中幾乎檢測不到，在Linc01060過表達的細胞中，細胞核中的MZF1水平顯著增加。
作為一種雙功能轉(zhuǎn)錄因子，MZF1通過與啟動子結(jié)合抑制或激活基因轉(zhuǎn)錄。MZF1與癌癥有，它轉(zhuǎn)位到細胞核并激活c-Myc，從而具有致癌作用，推測Linc01060在MZF1/c-Myc信號軸中起作用。免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)敲低Linc01060大大削弱了MZF1和c-Myc之間的相互作用。接下來探索Linc01060是否可以調(diào)節(jié)MZF1介導(dǎo)的c-Myc轉(zhuǎn)錄活性。熒光素酶報告基因檢測表明，單獨過表達MZF1及其與Linc01060的表達可增強轉(zhuǎn)錄活性。相關(guān)拯救實驗表明，Linc01060和MZF1的耗竭均可導(dǎo)致c-Myc轉(zhuǎn)錄活性顯著下降。檢測參與Warburg效應(yīng)的MZF1和c-Myc靶基因的表達，如HK、PGK1、LDHA、GLUT1和ENO1；發(fā)現(xiàn)Linc01060和MZF1共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致這些基因高表達；而敲低導(dǎo)致其低表達。表明Linc01060增強了MZF1介導(dǎo)的c-Myc轉(zhuǎn)錄活性。
作為一種雙功能轉(zhuǎn)錄因子，MZF1通過與啟動子結(jié)合抑制或激活基因轉(zhuǎn)錄。MZF1與癌癥有，它轉(zhuǎn)位到細胞核并激活c-Myc，從而具有致癌作用，推測Linc01060在MZF1/c-Myc信號軸中起作用。免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)敲低Linc01060大大削弱了MZF1和c-Myc之間的相互作用。接下來探索Linc01060是否可以調(diào)節(jié)MZF1介導(dǎo)的c-Myc轉(zhuǎn)錄活性。熒光素酶報告基因檢測表明，單獨過表達MZF1及其與Linc01060的表達可增強轉(zhuǎn)錄活性。相關(guān)拯救實驗表明，Linc01060和MZF1的耗竭均可導(dǎo)致c-Myc轉(zhuǎn)錄活性顯著下降。檢測參與Warburg效應(yīng)的MZF1和c-Myc靶基因的表達，如HK、PGK1、LDHA、GLUT1和ENO1；發(fā)現(xiàn)Linc01060和MZF1共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致這些基因高表達；而敲低導(dǎo)致其低表達。表明Linc01060增強了MZF1介導(dǎo)的c-Myc轉(zhuǎn)錄活性。
5. Linc01060由缺氧誘導(dǎo)，HIF-1α反式激活
研究引起膠質(zhì)瘤中Linc01060高表達的因素。c-Myc在轉(zhuǎn)錄后水平可增強HIF-1α的積累，保護其免受泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解。對Linc01060基因組序列上游~2 kb區(qū)域進行JASPAR和UCSC分析，發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)有一個預(yù)測的HIF-1α結(jié)合位點。缺氧或CoCl2預(yù)處理1天，Linc01060和HIF-1α水平明顯升高。在常氧和低氧條件下敲低HIF-1α基因可顯著抑制Linc01060的轉(zhuǎn)錄。ChIP–qPCR、熒光素酶結(jié)果證明HIF-1α直接結(jié)合到Linc01060基因啟動子區(qū)的相同染色質(zhì)片段。這些證明Linc01060是HIF-1α的直接轉(zhuǎn)錄靶點。
6. Linc01060通過促進有氧糖酵解促進膠質(zhì)瘤進展
生物信息學(xué)預(yù)測Linc01060可能參與腫瘤細胞的糖酵解代謝。耗氧量率(OCR)實驗檢測Linc01060在有氧糖酵解中的作用，發(fā)現(xiàn)沉默Linc01060增加了最大呼吸，而細胞外酸化率(ECAR)曲線表明敲低Linc01060顯著降低了U-87細胞中的糖酵解、糖酵解儲備和糖酵解能力，表明Linc01060促進糖酵解代謝。當Linc01060下調(diào)時，U-87細胞中18F-FDG攝取、乳酸生成和細胞ATP水平顯著降低。所有這些表明Linc01060可以調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的糖酵解代謝。
7. Linc01060通過調(diào)節(jié)MZF1/c-Myc/HIF-1α軸促進膠質(zhì)瘤進展
將MZF1、c-Myc或HIF-1α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到下調(diào)Linc01060的U-87 細胞中，顯著恢復(fù)對細胞增殖、葡萄糖攝取、乳酸生成和細胞ATP水平的抑制。證明Linc01060依賴于MZF1/c-Myc/HIF-1α信號軸調(diào)節(jié)細胞增殖和有氧糖酵解。
血清外泌體Linc01060與腫瘤進展有關(guān)為研究血清或腦脊液中外泌體Linc01060水平升高是否與膠質(zhì)瘤發(fā)生有關(guān)。從膠質(zhì)瘤患者和健康人群的血清和CSF中分離出外泌體，發(fā)現(xiàn)腫瘤患者循環(huán)外泌體中Linc01060水平較高，尤其是高級別膠質(zhì)瘤組織。腫瘤組織顯示Linc01060/MZF1/c-Myc/HIF-1α的高表達，尤其是在HGG中。此外，來自血清和CSF的循環(huán)外泌體中Linc01060表達水平與膠質(zhì)瘤組織中的表達水平呈正相關(guān)。這表明膠質(zhì)瘤組織中Linc01060的上調(diào)可導(dǎo)致循環(huán)外泌體中Linc01060水平升高。臨床數(shù)據(jù)強烈提示循環(huán)外泌體中高水平的Linc01060與膠質(zhì)瘤進展有關(guān)。單變量和多變量回歸分析顯示Linc01060水平是膠質(zhì)瘤患者的獨立預(yù)后指標，風(fēng)險比顯著。以上表明Linc01060可能是膠質(zhì)瘤的潛在生物標志物。
血清外泌體Linc01060與腫瘤進展有關(guān)為研究血清或腦脊液中外泌體Linc01060水平升高是否與膠質(zhì)瘤發(fā)生有關(guān)。從膠質(zhì)瘤患者和健康人群的血清和CSF中分離出外泌體，發(fā)現(xiàn)腫瘤患者循環(huán)外泌體中Linc01060水平較高，尤其是高級別膠質(zhì)瘤組織。腫瘤組織顯示Linc01060/MZF1/c-Myc/HIF-1α的高表達，尤其是在HGG中。此外，來自血清和CSF的循環(huán)外泌體中Linc01060表達水平與膠質(zhì)瘤組織中的表達水平呈正相關(guān)。這表明膠質(zhì)瘤組織中Linc01060的上調(diào)可導(dǎo)致循環(huán)外泌體中Linc01060水平升高。臨床數(shù)據(jù)強烈提示循環(huán)外泌體中高水平的Linc01060與膠質(zhì)瘤進展有關(guān)。單變量和多變量回歸分析顯示Linc01060水平是膠質(zhì)瘤患者的獨立預(yù)后指標，風(fēng)險比顯著。以上表明Linc01060可能是膠質(zhì)瘤的潛在生物標志物。
