癌細胞重新連接代謝網絡，以提供細胞分裂和快速生長所需的能量和生物合成中間體的穩定來源。然而，這會導致產生毒性代謝副產物，包括活性氧(ROS)，可促進氧化應激并損害癌細胞活力。因此，選擇上調氧化應激防御程序的腫瘤細胞來克服氧化應激的毒性，這是阻礙腫瘤起始和進展的一個重大障礙，轉錄因子NRF2是氧化應激反應中細胞氧化還原穩態的主要調節因子。NRF2激活可誘導抗氧化劑以及谷胱甘肽(GSH)合成相關酶的表達，并通過調節磷酸戊糖和絲氨酸生物合成途徑中的酶促進煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的生成。穩態條件下，NRF2通過直接結合KEAP1在蛋白水平受到嚴格控制。值得注意的是，在多種類型的人類癌癥中經常觀察到誘導NRF2組成性激活的NFE2L2（編碼NRF2的基因）、KEAP1或CUL3突變。NRF2過度激活與較差的臨床預后相關，表明NRF2過度激活的癌細胞具有競爭適合性優勢。然而，NRF2過度激活賦予腫瘤細胞生存和增殖優勢的分子機制仍不明確。近期，哈佛醫學院細胞生物學系Brugge教授及其團隊利用肺鱗癌3D球體模型偶聯CRISPR-Cas9篩選，研究了NRF2過度激活介導的分子發病機制，為NRF2誘導的表型變化提供了關鍵的見解，相關文章以“3D Culture Models with CRISPR Screens Reveal Hyperactive NRF2 as a Prerequisite for Spheroid Formation via Regulation of Proliferation and Ferroptosis”為題發表在Molecular Cell雜志上，雜志影響因子15.584。

技術路線：

結果：

1、與2D單層細胞模型相比，肺癌細胞的3D球體模型更依賴于NRF2進行存活和增殖

為了檢測NRF2下調在傳統的2D單層和3D球體培養中的作用，作者建立了A549和H1437非小細胞肺腫瘤細胞系，在多西環素的控制下表達兩種不同的、可誘導的靶向NRF2 mRNA的shRNAs，發現與2D單層培養相比，NRF2下調導致3D培養中細胞數量顯著減少（圖A），且發現H1437和A549細胞中細胞數量減少程度的差異與NRF2表達和NRF2活性的降低有關（圖B）。在3D培養中生長8天（即早期階段）后，NRF2敲低的球體比沒有敲低的球體?。▓DC，D）。此外，在NRF2敲除的球體中，細胞增殖標記物Ki67的免疫熒光染色也降低（圖C，E），表明NRF2調控3D培養球體的增殖。在3D培養中生長12天（即晚期）后，NRF2敲除誘導A549球體中內部基質剝奪細胞的死亡（圖F–I），表明NRF2控制了球體形成晚期內基質剝奪細胞的存活。NRF2敲除誘導的表型是靶向的，因為shNRF2不能靶向NFE2L2突變體（NRF2*和NRF2**）（圖J–N）。

2、肺癌球體需要高NRF2活性

為了獲得NRF2基因標記，作者在癌癥基因組圖譜(TCGA)項目中挖掘了NRF2通路中具有頻繁基因改變的四種癌癥類型（LUSC、LUAD、頭頸部鱗狀細胞癌和宮頸鱗狀細胞癌）的主要患者數據，鑒定了1466個基因，這些基因在NRF2通路中有NRF2過度激活基因改變（NFE2L2突變/擴增或KEAP1或CUL3突變/缺失）的腫瘤中的表達顯著高于或低于無NRF2過度激活基因改變的腫瘤（圖A），獲得了55基因的NRF2簽名(圖B，2C)。NRF2標記基因的中位數標準化表達值被用作“NRF2評分”，作為一組癌細胞系NRF2過度激活的指標(圖C)。與3D培養的NRF2敲低數據一致，NRF2評分較低的肺癌細胞系不能有效形成球體，表明肺癌細胞系的NRF2評分與球體大小相關（圖D，E）。值得注意的是，在NRF2途徑中沒有基因改變但表現出較高NRF2評分的細胞系（即H520和SK-MES-1細胞）形成了球體，在NRF2途徑中有基因改變但表現出較低NRF2評分的細胞系（即H23細胞）沒有形成球體。有趣的是，一小部分表現出中間NRF2評分的H596細胞形成了球體，但表現出很強的內部細胞清除率（圖D）。因此，高NRF2活性對于瘤球體形成是必要的，至少在肺癌細胞系中是如此。

為進一步研究NRF2過度激活對球體形成的影響，作者通過CRISPR-Cas9證實KEAP1敲除增加了NRF2蛋白的表達和活性（圖F），且KEAP1敲除增加了兩種細胞系中球體的大?。▓DG–J），減輕了H596細胞中內球體細胞的死亡（圖I和J），表明高NRF2活性可以促進肺癌細胞中高效的球體形成。

3、抗氧化劑不能挽救NRF2下調引起的增殖缺陷

鑒于NRF2調節細胞抗氧化序，作者研究了2D與3D培養條件下的細胞氧化還原狀態。相對于2D培養，3D培養顯示ROS水平增強和GSH/GSH二硫化物(GSSG)水平降低（圖A，B），表明與單層細胞相比，球體細胞受到更多的氧化應激。接下來用抗氧化劑NAC或GSH-EE處理，發現NRF2敲除后A549和H1437球體模型內部細胞的存活率顯著增加（圖C-E）。相反，基于Ki67信號或H1437球體的大小，這些抗氧化劑并不能挽救NRF2缺失導致的球體增殖抑制（圖F–H），表明抗氧化劑反應不足以促進NRF2介導的球體增殖。因此，這些結果表明NRF2通過不同的機制調節肺癌球體中內部細胞的存活和增殖。

4、CRISPR-Cas9篩選NRF2過度激活誘導球體生長的關鍵基因

為了確定介導NRF2過度激活誘導球體生長的關鍵基因和/或程序，在A549和H1437細胞中進行了CRISPR-Cas9篩選，選擇最有可能在NRF2過度活化的腫瘤中發揮作用的基因，即與人類腫瘤中NRF2過度活化的基因改變顯著相關的基因（A），通過去除肺腫瘤或KEAP1/CUL3/NFE2L2改變的細胞系中低水平表達的基因和與NFE2L2共擴增或與KEAP1/CUL3共缺失的基因，繪制列表（圖B），總計14058個sgRNA靶向大約1500個基因（圖B）。作者在2D和3D培養條件下同時在A549和H1437細胞中進行合并的CRISPR-Cas9篩選（圖C），與2D培養條件相比，3D條件下兩種細胞系中富集或耗盡（D）。值得注意的是，在3D培養條件下最一致和顯著的命中表示更大的依賴性，包括富集靶向TSC1的sgRNA和耗盡靶向GPX4的sgRNA。

5、鐵死亡對瘤球體增殖和內部細胞存活的影響

A549和H1437細胞中最顯著的脫落打擊是GPX4，形成球體后，用GPX4抑制劑ML210處理的球體顯示A549、H1437和H520細胞內腔空間的細胞存活率下降（圖A，B）。為了闡明與NRF2敲除球體內部細胞死亡是否由鐵死亡介導，在Fer-1（鐵死亡抑制劑）存在的情況下培養A549和H1437球體，發現Fer-1處理阻止NRF2敲除球體內部細胞死亡（圖C，D），提示NRF2通過保護鐵死亡調節內部細胞存活，然而用Fer-1處理球體并不能增加球體大?。▓DE–G），這表明NRF2介導的增殖調控并不涉及對鐵死亡。NRF2敲除增加了A549和H1437球體中H2O2的水平（圖H），表明NRF2通過降低細胞ROS水平抑制脂質過氧化。值得注意的是，通過BODIPY測定發現NRF2敲低以及ML210處理顯著增加了球體內部的脂質過氧化物水平（圖I，J），表明球體內部細胞容易受到脂質過氧化的影響，NRF2能調節球體的脂質過氧化。NRF2敲除沒有增加細胞內Fe2+和ACSL4的表達水平，（圖K，L），表明NRF2敲除的細胞對鐵死亡的敏感性增加不是由于Fe2+或ACSL4。這些結果表明NRF2通過球體中抗氧化劑依賴的途徑調節內部細胞的存活。

6、NRF2和GPX4之間的關系

作者檢測了NRF2下調細胞中的GPX4水平，發現在2D和3D培養條件下，NRF2下調顯著增加了GPX4水平（圖A，B）。作者通過等壓串聯質量標簽(TMT)標記結合液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)分析（圖C），發現大多數檢測到的硒蛋白在NRF2下調后表現出表達增加（圖D，E）。這表明NRF2敲除后GPX4的表達增加并不是特有的。相反，TXNRD1，一個真正的NRF2靶基因，在NRF2敲除后強烈降低，即使TXNRD1也是一種硒蛋白（圖E），推測NRF2敲低細胞中TXNRD1蛋白水平的降低會增加其他硒蛋白的硒利用空間，導致增加硒蛋白的表達。

7、靶向NRF2和GPX4導致肺癌球體中大量細胞死亡

鑒于球體細胞表現出更高水平的脂質過氧化，作者觀察到NRF2下調增加GPX4的表達，球體內外細胞可能具有不同的氧化應激能力，用ML210處理NRF2敲除的球體導致球體內部和外部細胞死亡（圖A，B）。接下來研究了NRF2下調聯合GPX4活性抑制在3D培養中是否具有特異性致死性，或者這種組合在2D培養條件下是否也對細胞具有致死性，發現A549細胞即使在2D培養條件下無基因操作也對ML210敏感，而H1437、H520和SK-MES-1細胞不太敏感或不敏感（圖C，左圖）。在2D培養中，NRF2下調使A549、H1437、H520和SK-MES-1細胞對ML210輕微敏感（圖C，左圖）。在3D培養中，shNRF2的誘導使細胞對ML210更敏感（圖C，右圖）。在2D和3D培養條件下，與Fer-1共同處理可完全挽救對ML210的敏感性（圖D，E）。KEAP1敲除增強了ML210處理的H596細胞中球體內部細胞的存活率（圖D），這揭示了NRF2在NRF2過度活化的肺癌細胞系中的作用。作者評估了NRF2和GPX4聯合缺失是否加劇了脂質過氧化以增強細胞死亡（圖F，G），在shGFP轉導的對照A549球體中，ML210處理增加了脂質過氧化，特別是在球體內部區域。在NRF2敲除的A549球體中，ML210處理增加了球體內外區域的脂質過氧化，盡管與球體外區域相比，內區域的誘導更顯著。有趣的是，ML210處理的NRF2敲低球體外部的脂質過氧化水平與無ML210處理的NRF2敲低球體和有ML210處理的shGFP球體內部的脂質過氧化水平相當（圖7G）。因此，需要多種氧化應激防御程序的聯合靶向作用來高效殺死腫瘤細胞。

結論：

1.NRF2是肺腫瘤球體增殖和存活所必需的。

2.NRF2阻止內部基質剝奪瘤球體的鐵死亡。

3.NRF2通過改變曬利用調控硒蛋白的表達。

4.靶向NRF2能夠有效殺死瘤球體細胞。

參考文獻：

Nobuaki T, Patricia C, Laura MS, et al. 3D Culture Models with CRISPR Screens Reveal Hyperactive NRF2 as a Prerequisite for Spheroid Formation via Regulation of Proliferation and Ferroptosis. Molecular Cell. 2020.