胎兒生長受限（FGR）是造成圍產期死亡和發病的主要原因，影響胎兒長期健康。為了確定妊娠期核心基因表達網絡和基因特征，結合超聲確認可以更有效地區分胎齡和病理性FGR群體的正常體質，作者對臍帶血進行了全轉錄組測序。本文于2020年9月發表于《Clinical and translational medicine》期刊上。

技術路線如下：

主要研究結果如下：

1、FGR和對照臍帶血的轉錄組明顯不同

對正常組和FGR組的臍帶血進行全轉錄組測序，如圖1， 作者分析了兩種情況下的蛋白編碼基因、lncRNAs和miRNAs的差異表達情況，其中蛋白編碼基因在FGR組傾向于下調表達，而lncRNAs和miRNAs則傾向于上調表達。作者還列舉了FGR家族的代表性表達情況（圖1d和e）。

圖1 FGR和對照臍帶血的轉錄組明顯不同

 2、差異表達的蛋白質編碼基因和生理功能信號通路

總計鑒定到339個差異表達的蛋白質編碼基因，與對照相比，在FGR組上調的有224個，下調的是115個。圖2b-c是下調的基因富集到的GO條目和KEGG通路；圖2d-e是下調的基因富集到的GO條目和KEGG通路。隨后作者使用GSEA分析了這些差異表達基因涉及的信號通路，如圖2f-i。

圖2差異表達的蛋白質編碼基因和生理功能信號通路

 3、差異表達的miRNA和生理功能信號通路

基于具有較大log2（倍數變化）的前30個高度變化的miRNA，包括13個顯著差異表達的miRNAs，預測它們的靶基因，并展示出最常見的前30個靶基因（圖3b）。隨后分析了這些靶基因的GO和KEGG分析的結果（圖3c-d）。利用人類MicroRNA疾病數據庫(HMDD, v2.0)對預測靶點和人類疾病的綜合分析表明，這些miRNA與免疫細胞和已發表的疾病顯著相關（圖3e）。此外，這些miRNA優先聚類于miR-194家族和Chr14_100911139-100911213 cluster（圖3f-g）。上述結果表明這些差異表達的miRNAs不僅與FGR相關的疾病有關，而且還集中于特定的基因簇和各種疾病。

圖3差異表達的miRNA和生理功能信號通路

 4、FGR的核心調控網絡和印跡基因

測序中總計鑒定到79個顯著下調和216個顯著上調的lncRNAs（圖4a）。研究發現在339個編碼基因和295個lncRNAs間顯示出7個lncRNAs在一個2kb的區域順式調節其鄰近的蛋白質編碼基因（圖4b），此外也獲得了7616個反式調節的lncRNAs。為了清楚地展示反式調控關系，作者將差異表達程度較大的前35個lncRNA和蛋白編碼基因顯示出來(圖4c)。結合lncRNA-mRNA，miRNA-mRNA和miRNA-lncRNA分析，在用Pearson相關系數（PCC）（絕對值> 0.9）篩選后，觀察到7個順式，59個反式和2個miRNA調控關系（圖4d）。具有順式調控關系的lncRNA和蛋白質編碼基因的PCC為正，而具有lncRNA及其反式調控的蛋白質編碼基因的PCC為負（圖4e）。

由于印跡基因在生長發育中非常重要，所以作者基于240個印跡基因進行了進一步分析（圖4f），這些印跡基因與FGR呈顯著負相關，其中有6個印跡基因在FGR組和對照組間差異表達，如Col9a3，Dlk1，Fuca1，Lilrb4，Sfrp2和Ventx（圖4i）。這些結果觀察到一簇印跡基因與FGR相關可能為FGR提供了潛在的標志物。

圖4 FGR的核心調控網絡和印跡基因

 5、關鍵基因共表達網絡模塊與FGR密切相關

為了闡述FGR中重要的基因共表達網絡，作者進行了WGCNA并將FGR和對照組進行了全轉錄組聚類（圖5a）。所有的這些基因聚為18個模塊，大部分基因聚類在綠松石色模塊，富集于中性粒細胞脫顆粒（圖5b）。皮爾遜相關系數分析了網絡模塊和樣品性狀間的關系，結果顯示綠松石和紫色模塊與出生重量顯著正相關，而綠松石和午夜藍模塊在FGR組和對照組間顯著差異（圖5c）。模塊的穩定性分析表明前四個模塊，包括綠松石，藍色，棕色，和黃色模塊都展示出較高的穩定性（圖5d）。層次聚類分析表明綠松石模塊與出生重量顯著相關并且可以明顯區分FGR組和對照組（圖5e）。GO富集和通路分析表明綠松石模塊主要富集于腫瘤中破骨細胞分化和癌癥中轉錄失調（圖5f）。這些結果表明關鍵模塊綠松石與FGR顯著相關，但是模塊中的基因的進一步大樣本驗證研究將有助于為FGR提供更多的證據。

圖5 關鍵基因共表達網絡模塊與FGR密切相關

 6、蛋白質編碼基因、lncRNA和miRNAs作為FGR的潛在標記

作者對轉錄組中的差異表達基因進行了qRT-PCR驗證包括兩個印跡基因（Sfrp2 and Dlk1），一個蛋白編碼基因Slpi，5個lncRNAs（圖6a）。ROC曲線顯示，RP11_552M6.1、LINC01291、Asgr1的曲線下面積(AUC)值可達到0.958，表明具有顯著預測FGR的潛力（圖6b）。為了觀察其在臨床應用的潛力，檢測了12對FGR病例和對照產婦外周血標本中差異表達分子的表達水平。ROC曲線表明Sfrp2、miR-432-5p、miR- 1306-3p在FGR產婦外周血中的表達模式具有顯著的預測能力(AUC = 0.882)（圖6c）。這些結果表明這些蛋白編碼基因，lncRNAs，miRNAs都與FGR密切相關，并且可能為FGR提供潛在的標志物。

圖6蛋白質編碼基因、lncRNA和miRNAs作為FGR的潛在標記

總之，這項研究全面剖析了人類臍帶血的轉錄組全貌，構建了核心基因共表達網絡，描繪了包括與FGR相關的印跡基因在內的關鍵基因特征，并提供了對子宮內擾動和FGR候選特征的關鍵見解。 然而，在妊娠早期對大樣本量的診斷意義還需要進一步探索，并且需要進行功能和機理研究以為闡明FGR提供更多證據。

參考文獻：

Wang Guiying., Yu Jun., Yang Yiwei., Liu Xiaoqin., Zhao Xiaobo., Guo Xudong., Duan Tao., Lu Chenqi., Kang Jiuhong.(2020). Whole-transcriptome sequencing uncovers core regulatory modules and gene signatures of human fetal growth restriction. Clin Transl Med, 9(1), 9. doi:10.1186/s40169-020-0259-0