研究背景：

KRAS是人體腫瘤中最常見的突變癌基因。盡管很多研究報道了KRAS突變對癌細胞的影響，但是致癌KRAS的激活對免疫細胞的直接影響仍不清楚。文章研究細胞外KRAS^G12D作為癌細胞-巨噬細胞間通信的關鍵中介（IF= 9.77）。

技術路線圖：

研究結果：

1. 在自噬依賴性鐵下垂癌細胞死亡中，KRAS^G12D在胞外釋放

胰腺導管腺癌（PDAC）的發(fā)生和發(fā)展與氧化應激有關。在人PDAC細胞系（PANC1和AsPC1，都發(fā)生KRAS^G12D突變）確定氧化應激是否會誘導癌蛋白的釋放。H₂O₂以時間依賴性的方式誘導NC1和AsPC1細胞以及人初級PDAC細胞(pHsPDAC)釋放KRAS^G12D (圖1A)。提示氧化應激引起PDAC細胞釋放KRAS^G12D。H₂O₂可以觸發(fā)多種形式的調控細胞死亡，比如細胞凋亡，壞死和自噬依賴的細胞死亡。H₂O₂誘導的細胞死亡(圖1B)和PDAC細胞釋放KRAS^G12D(圖1C)被自噬抑制劑阻斷（chloroquine），但是凋亡抑制劑或壞死凋亡抑制劑（Z-VAD-FMK和necrosulfonamide）沒有這種作用。敲除自噬相關基因限制了H₂O₂誘導的細胞死亡和KRAS^G12D的釋放（圖1E-1G），進一步證實自噬依賴性細胞死亡促進氧化應激期間KRAS^G12D蛋白釋放。

鐵死亡抑制劑(ferrostatin-1和baicalein)阻斷H₂O₂誘導的MAP1LC3B的斑點形成(圖1H)，抑制PDAC細胞死亡(圖1B)和KRAS^G12D釋放(圖1C)。Erastin和RSL3等鐵死亡誘導劑也能誘導MAP1LC3B斑點(圖1I)、MAP1LC3B脂化(產生MAP1LC3B II)和KRAS^G12D釋放(圖1K)。敲除ATG5逆轉這些效應(圖1I - 1k)。結果提示鐵死亡可導致PDAC細胞中KRAS^G12D蛋白的釋放。

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2. 巨噬細胞外泌體攝取KRAS^SG12D需要AGER

之后研究了KRAS^G12D蛋白是否存在于外泌體中。電子顯微鏡、納米顆粒分析和WB檢測外泌體分離方法的純度。囊泡大小50-150nm (圖2A、2B)，WB檢測CD63、CD81、PDCD6IP/ALIX、TSG101、HSP90B1 / GRP94和CYCS (圖2C)進一步證明。在PANC1和AsPC1細胞分離的外泌體中，H₂O₂刺激導致KRAS^G12D蛋白(不影響CD63和PDCD6IP/ALIX)的增加；氯喹和ferrostatin-1阻斷了KRAS^G12D蛋白的積累(圖2D)；敲除自噬相關基因ATG5或應用GW4869（外泌體生成和釋放的抑制劑）抑制了H₂O₂誘導的KRAS^G12D蛋白的積累(圖2E，F(xiàn))。外泌體分泌的關鍵調節(jié)因子RAB27A的敲除也抑制了H₂O₂誘導的PANC1細胞釋放KRAS^G12D (圖2G)。KRAS^G12D和PDCD6IP/ALIX均對蛋白酶K不敏感，但被Triton X-100降解(圖2I)。這些發(fā)現(xiàn)表明自噬依賴的鐵死亡導致KRAS^G12D從外泌體釋放。

之后研究腫瘤來源外泌體中的KRAS^G12D蛋白是否能被巨噬細胞吸收。人外周血單核細胞來源巨噬細胞(PBMCMs)通常不含KRAS^G12D，但以時間依賴性的方式吸收H₂O₂產生的癌癥外泌體(圖2J)，提示腫瘤KRAS^G12D可進入巨噬細胞。AGER抗體抑制H₂O₂生成的癌癥外泌體培養(yǎng)的PBMCMs對KRAS^G12D的攝取(圖2K)。類似地，在PBMCMs中，敲除AGER損害了KRAS^G12D從腫瘤來源外泌體的攝取(圖2L)。結果表明，AGER介導巨噬細胞攝取KRAS^G12D

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3. KRAS^G12D通過STAT3依賴性脂肪酸氧化促進巨噬細胞M2極化

巨噬細胞攝取KRAS^G12D可能影響巨噬細胞極化。敲除PBMCMs中KRAS^G12D，并檢測M1分化(IL-12A、TNF和NOS2/iNOS)或M2極化(IL-10、ARG1和TGFB1)的生物標志物。

表達KRAS^G12D的PBMCMs中IL-10、ARG1和TGFB1 mRNA（M2極化）表達上調(M1極化不變)；H₂O₂產生的癌癥外泌體也增加了PBMCMs產生的M2 mRNA表達， AGER敲除所逆轉(圖3A)。因此，KRAS^G12D的攝取可能導致促癌的M2極化。脂肪酸氧化的情況類似(圖3B)。脂肪酸氧化抑制劑Etomoxir降低了KRAS^G12D表達或PDAC細胞來源的外泌體的PBMCMs中IL10、ARG1和TGFB1 mRNA表達(圖3A)。因此，脂肪酸氧化有助于KRAS^G12D介導的M2巨噬細胞極化。

為了解KRAS^G12D驅動的巨噬細胞中脂肪酸氧化加劇的機制，文章重點研究了STAT3。 WB分析發(fā)現(xiàn)在表達KRAS^G12D或腫瘤外泌體處理的PBMCMs中，STAT3的磷酸化水平上調(圖3C)。與AGER的敲除類似，在KRAS^G12D或H₂O₂誘導的癌癥外泌體的PBMCMs中，敲除STAT3減少脂肪酸氧化(圖3B)和M2巨噬細胞極化(圖3A)。因此，AGER介導的STAT3的活化需要KRAS^G12D-誘導脂肪酸氧化和巨噬細胞極化。

之后，確定參與脂肪酸氧化代謝途徑的基因是否會被AGER介導的STAT3激活所調控。在表達KRAS^G12D的PBMCMs中，其他脂肪酸氧化相關基因(如CPT1B, CPT1C, CPT2, ACADL, ACADSB, ACAD9, ACAD10, ACAD11,ACADS,ACADVL,和ACAA2)上調 (圖3 D)。這一效應被敲除AGER或STAT3抑制(圖3D)。在KRAS^G12D表達或對癌癥外泌體應答的PBMCMs中，敲除CPT1A和ACADM抑制脂肪酸氧化(圖3B)和IL10、ARG1和TGFB1 mRNA表達(圖3A)。結果表明AGER-STAT3通路對于KRAS^G12D誘導的脂肪酸氧化和隨后的巨噬細胞M2極化至關重要。

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4. 體內阻斷KRAS^G12D的釋放和攝取抑制巨噬細胞介導的胰腺腫瘤生長

探索KRAS^G12D蛋白從癌細胞向巨噬細胞的可能路徑。在NOD SCID小鼠背側皮下注射PANC1細胞或PANC1細胞+PBMCMs。與單用PANC1細胞相比，PBMCMs促進了胰腺腫瘤的生長(圖4A)。局部注射氯喹、ferrostatin-1或抗AGER抗體可抑制PANC1+PBMCMs引起的腫瘤的生長 (圖4)。AGER的敲除(圖4B)降低了由PANC1細胞+PBMCMs引起的腫瘤生長。此外，KRAS^G12D驅動的PBMCMs比野生型PBMCMs更能促進胰腺腫瘤的生長(圖4C)。當STAT3、ATG5、CPT1A或RAB27A敲除時，PBMCMs表達KRAS^G12D的腫瘤加速作用消失(圖4C)。這些發(fā)現(xiàn)表明，KRAS^G12D或KRAS^G12D轉入PBMCMs可通過ATG5、STAT3、CPT1A和RAB27A等通路驅動PDAC的進展。

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5. 巨噬細胞中KRAS^G12D的高表達與PDAC患者較差的生存相關

為了確定在人類胰腺癌中KRAS^G12D在巨噬細胞表達異常，分析59個PDAC病人(表1)。在CD68⁺巨噬細胞中檢測出KRAS^G12D表達(圖5A)。PDAC病人CD68⁺巨噬細胞中有高KRAS^G12D顯示短生存期，比病人含有低KRAS^G12D在腫瘤浸潤性CD68 +巨噬細胞 (圖5B)。這些發(fā)現(xiàn)表明巨噬細胞攝取KRAS^G12D的增加可能促進了人PDAC的進展。

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