潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩病統稱為炎癥性腸病(IBDs)，是一種全球性疾病，在發達國家發病率很高(0.3%)，在發展中國家發病率正在迅速升高，導致大量的醫療保健費用和工作生產力的損失。本文發現了由循環和NF-κB驅動的lncRNA（Lnc-UC）通過表觀遺傳修飾了生物鐘基因Rev-erbα的轉錄，從而將生物鐘與結腸炎聯系起來。本文于2020年10月發表于《Science Advances》IF：13.116。

技術路線如下：

該文主要結果如下：

1、Lnc-UC是一個循環和大腸桿菌相關的lncRNA

結腸炎和正常小鼠RNA測序，篩選到197個差異表達的lncRNA，其中有28個是循環相關的，包括Lnc-UC (ENSMUST00000124503.1)（圖1A-C）。Lnc-UC的表達具有明顯的晝夜性，在ZT10時顯著高表達，原位雜交(CISH)證實了小鼠結腸中存在Lnc-UC，且在其它組織中也存在表達，包括肺、心、腦、腎、腹膜巨噬細胞（PMs）等（圖1D-F）。Lnc-UC主要分布于結腸細胞和骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）的細胞核中（圖1G-H）。

2、NF-κB驅動結腸炎小鼠表達Lnc-UC

KEGG揭示結腸炎與NF-κB通路及其相關通路的激活有關，如NF-κB靶向基因Ptgs2，IL-1β和Cxcl2的表達升高（圖2A-B）。無論是BMDMs中還是血漿BMDMs 或者PMs中Lnc-UC的表達與LPS誘導的劑量和時間有依賴性（圖C-F）。此外，重組Tnfα蛋白（NF-κB激活劑）和p65（NF-κB亞基）的過表達質粒都能誘導BMDMs中Lnc-UC的表達，而JSH-23（NF-κB抑制劑）則抑制Lnc-UC的表達（圖2G-I）。雙熒光素酶實驗鑒定到兩個Lnc-UC啟動子與p65結合的區域，而重組Tnfα蛋白增強了p65募集至結合位點（圖2）。總之，NF-κB驅動Lnc-UC的表達通過轉錄激活機制。

圖2 NF-κB驅動結腸炎小鼠表達Lnc-UC

3、Lnc-UC在體外調節炎癥

將Lnc-UC過表達和對照的BMDMs細胞用于RNA測序，發現Lnc-UC誘導免疫應答相關基因表達發生顯著變化（圖3A-B）。通過獲得與缺失實驗證實Lnc-UC是NF-κB靶向基因（包括Nlrp3, IL-6, Tnfα, IL-1β, and IL-18)）的負調節劑（圖3C-D）。Lnc-UC敲除誘導的NF-κB靶向基因表達的改變可以通過Lnc-UC過表達恢復，表明Lnc-UC對NF-κB有特殊的作用（圖3E）。與此一致，Lnc-UC抑制NF-κB的轉錄活性（圖3F-G）。這表明Lnc-UC在NF-κB信號和炎癥中扮演抑制作用。

圖3 Lnc-UC作為炎癥調節因子

4、Lnc-UC消融使小鼠對實驗性結腸炎敏感

作者構建了Lnc-UC敲除小鼠（Lnc-UC^?/?），然后和WT鼠一起藥物誘導發生實驗性結腸炎，結果顯示Lnc-UC^?/?小鼠對結腸炎的敏感性增加，體重丟失更大，疾病活性指標更高，結腸更短（圖3H-K）。并且，Lnc-UC^?/?小鼠結腸炎病理更嚴重，此外，其預后與晝夜節律性顯著相關（圖3L-P）。總之，這些結果表明Lnc-UC調節小鼠晝夜性結腸炎。
          Lnc-UC調節生物鐘基因Rev-erbα和炎癥。Lnc-UC缺失導致生物鐘基因表達中斷，特別是Rev-erbα（圖4A-B）。據報道Rev-erbα通過NF-κB信號通路和Nlrp3炎性小體參與生物鐘和結腸炎的調節。因此探究其在Lnc-UC炎性機制中的作用。結果顯示過表達Rev-erbα導致免疫響應相關基因表達改變，敲除Rev-erbα則導致炎性分子表達上調（圖4C-D）。作者觀察到，在BMDMs中，Lnc-UC和Rev-erbα相關的炎癥富集通路高度重疊（圖4E）。此外，Lnc-UC減少了Rev-erbα靶基因Nlrp3的表達，而這種抑制作用在Rev-erbα敲除小鼠中不存在（圖4F）。由于RIP顯示Lnc-UC和Rev-erbα不存在相互作用（圖4G），所以作者進一步探究了其作用機制，結果發現過表達Lnc-UC導致細胞中Rev-erbα表達升高但是其靶基因Bmal1的表達減少，敲除則相反（圖4H-I）。這些數據表明Lnc-UC獲得的抗炎效果可能通過調節Rev-erbα的表達。

圖4 Lnc-UC調節生物鐘基因Rev-erbα和炎癥

5、Lnc-UC通過與Cbx1相互作用，表觀遺傳調控Rev-erbα

Lnc-UC包括4個莖環結構可能用于靶向調控其它蛋白，實驗表明Cbx1作為一個核蛋白可以與Lnc-UC相互作用（圖5A-E）。結合位點位于1-74nt和326-432nt片段區域，一旦該區域突變，則不能調控Rev-erbα的表達和抑制炎癥反應（圖5F）。Lnc-UC敲除增強了H3K9的三甲基化，增加了對Rev-erbα的表觀遺傳調控的可能性（圖5G）。ChIP實驗顯示Cbx1，Suv39h1和H3K9me3在Rev-erbα啟動子區域顯著富集，而Lnc-UC敲除增強了這種富集作用（圖5H）。此外，Cbx1敲除則減少了H3K9me3在Rev-erbα啟動子區域富集，促進了Rev-erbα的表達和轉錄（圖5I-J）。總之，Lnc-UC通過減弱Cbx1介導的H3K9三甲基化來調控Rev-erb轉錄(圖5K)。具體地說，Lnc-UC可能作為誘餌，吸引從Rev-erb啟動子中去除Cbx1及其伙伴Suv39h1(圖5K)。因此，H3K9的三甲基化減弱，Rev-erb轉錄被激活(圖5K)。

圖5 Lnc-UC與Cbx1和調節Rev-erbα轉錄通過減少H3K9的三甲基

6、hLnc-UC是一種循環、抗炎的lncRNA

探究Lnc-UC在小鼠中的功能能否由于高度的物種保守而存在于人類中，是很有意義的。因此，在人的樣本中檢測其是否存在，如圖6A，人Lnc-UC（hLnc-UC）被擴增出來。并且hLnc-UC能在人結腸中檢測到，結腸炎患者表現出hLnc-UC，NLRP3，IL-1β表達升高（圖6B-C）。hLnc-UC在血清的THP-1細胞中有規律地表達，其模式類似于BMAL1（圖6D）。 此外，hLnc-UC在THP-1細胞中的過表達導致Rev-erbα表達增加和Rev-erbα依賴性炎癥因子水平降低（圖6E-G）。在單核細胞衍生的巨噬細胞中也觀察到了類似的結果（圖6H-I）。 總之，這些數據表明，與結腸炎相關的hLnc-UC可能像在小鼠中一樣促進Rev-erbα表達以抑制炎癥。

圖6 hLnc-UC是一種循環、抗炎的lncRNA

NF-κB驅動的Lnc-UC充當Rev-erbα的表觀遺傳調控因子，從而協調了晝夜節律和結腸炎。 Lnc-UC可能在干預炎癥和晝夜節律之間的交流并控制結腸炎。

參考文獻：

Wang Shuai., Lin Yanke., Li Feng., Qin Zifei., Zhou Ziyue., Gao Lu., Yang Zemin., Wang Zhigang., Wu Baojian.(2020). An NF-κB-driven lncRNA orchestrates colitis and circadian clock. Sci Adv, 6(42), undefined. doi:10.1126/sciadv.abb5202