導語：獲得性化療耐藥是膠質母細胞瘤(GBM)臨床治療的一大挑戰。環狀RNA已被證實在腫瘤化療耐藥中起作用。然而，其潛在機制仍不清楚。今天小編給大家分享一篇關于CircRNA與膠質母細胞瘤耐藥的研究，探一探關于腫瘤耐藥別的研究思路。

技術路線

結果：

1. CircASAP1在TMZ治療后TMZ耐藥的GBM細胞和組織中高表達

   收集3對術后和替莫唑胺治療后的原發性（Pri GBM）和復發性（Rec GBM）膠質母細胞瘤組織樣本，測序鑒定出在Rec GBM 中上調最多的circASAP1，CircASAP1在兩種TMZ耐藥細胞系N3T3rd和U251T3rd中的表達顯著高于TMZ敏感細胞系（N3s和U251s）。Kaplan-Meier分析確定circASAP1低表達的患者在TMZ治療后比circASAP1高表達的患者表現出更好的OS。Sanger測序、PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測、轉錄抑制劑放線菌素D處理及RNase R處理鑒定CircASAP1的環狀結構。這些表明在TMZ耐藥的GBM細胞系和組織中circASAP1表達上調，指出circASAP1與獲得性TMZ耐藥之間可能存在關系。

2. CircASAP1在體外促進增殖和TMZ耐藥
   探索circASAP1在GBM腫瘤發生和獲得性TMZ耐藥中的作用。耐藥細胞敲除circASAP1可顯著抑制細胞增殖，下調circASAP1可明顯增強細胞凋亡的水平，激活caspase-3及其底物PARP的裂解。當過表達circASAP1時，TMZ誘導的細胞增殖被促進、細胞凋亡減少。這些結果表明敲低circASAP1可抑制TMZ耐藥細胞的增殖，恢復TMZ敏感性。

3. RNA結合蛋白EIF4A3調控circASAP1的表達

   為探索circASAP1在GBM中是如何差異表達的，CircInteractome預測與circASAP1側翼區匹配的RNA結合蛋白位點，其中EIF4A3的結合位點最多。RNA pull-down實驗驗證EIF4A3與circASAP1的下游側翼序列結合。EIF4A3的下調導致circASAP1表達減少，而過表達EIF4A3可增加circASAP1表達。此外，在15個臨床樣本中circASAP1和EIF4A3之間存在正相關性。沉默circASAP1并沒有改變EIF4A3 mRNA或蛋白水平。總之，EIF4A3通過與側翼序列結合增加circASAP1的表達。

4. CircASAP1作為miR-502-5p的海綿
   研究了circASAP1潛在的功能機制。核質分離檢測和FISH分析CircASAP1主要分布于細胞質。CircASAP1可以直接與RNA誘導沉默復合體(RISC)的核心組分Argonaute-2(Ago2)結合，熒光素酶報告基因結果進一步證實circASAP1可能作為Ago2和miRNA的結合平臺。CircInteractome數據庫預測21個候選miRNA，5個miRNA（miR-136、miR-566、miR-1205、miR-145和miR-502-5p）能夠降低熒光素酶報告活性至少30%。為確定哪些miRNA在腫瘤抑制中起作用，將單個miRNA模擬物轉染到TMZ耐藥細胞中，發現miR-502-5p可顯著抑制細胞生長；特異性生物素化的miR-502-5p探針成功捕獲circASAP1；miR-502-5p介導的熒光素酶活性抑制被預測結合位點內circASAP1的突變恢復，證實了circASAP1和miR-502-5p之間的直接相互作用。

   circASAP1缺失的耐藥細胞中敲低或過表達miR-502-5p，miR-502-5p過表達明顯抑制細胞生長，而敲低miR-502-5p促進細胞增殖，miR-502-5p恢復了circASAP1缺失的耐藥細胞的TMZ耐藥性，而miR-502-5p抑制劑逆轉了這一效應。同樣，miR-502-5p過表達明顯增加caspase-3的凋亡比率和活化。綜上所述，circASAP1作為miR-502-5p的分子海綿，兩者都參與GBM獲得性TMZ耐藥的分子機制。

5. NRAS是miR-502-5p的內源性靶點
   數據庫與KEGG通路分析預測miR-502-5p的8個靶標，上調miR-502-5p可降低NRAS表達，而anti-miR-502-5p則表現出相反作用。TMZ耐藥細胞NRAS表達高于TMZ敏感細胞，CircASAP1與NRAS表達呈正相關。miR-502-5p直接結合到NRAS 3’-UTR區域，miR-502-5p抑制劑和模擬物分別使NRAS蛋白水平升高和降低。RIP檢測發現NRAS可與Ago2結合。在tmz耐藥細胞中，CircASAP1敲低導致招募到NRAS轉錄本的Ago2顯著增加。TMZ敏感細胞中circASAP1過表達導致Ago2的富集增加，但與NRAS轉錄本結合的Ago2的富集減少。敲低circASAP1表達顯著降低NRAS mRNA和蛋白水平。

   circASAP1敲低后NRAS報告基因的熒光素酶活性下降，被miR-502-5p抑制劑挽救。在circASAP1過表達時，NRAS WT報告基因的熒光素酶活性升高，miR-502-5p模擬物消除這種效應。NRAS的RNA和蛋白水平受circASAP1和miR-502-5p的調控。這些數據證明circASAP1作為miR-502-5p的分子海綿促進NRAS的表達。

6. CircASAP1通過NRAS/MEK1/ERK1/2信號促進腫瘤生長和TMZ耐藥

   NRAS參與多個信號通路的調節，敲低NRAS表達可降低TMZ耐藥細胞的克隆形成，過表達NRAS可恢復circASAP1缺失的TMZ耐藥細胞對TMZ的耐藥性。sh-circASAP1抑制NRAS/MEK1/ERK1/2信號的激活，但過表達circASAP1激活這種信號。這些結果證明NRAS在circASAP1介導的TMZ耐藥中對細胞生長和凋亡抑制發揮調節作用，circASAP1通過NRAS/MEK1/ERK1/2途徑調節細胞凋亡。

   研究circASAP1在體內對耐藥表型的影響。熒光素酶標記的sh-circASAP1-或sh-ctrl轉導的N3T3rd細胞注射到裸鼠體內，發現circASAP1缺失的N3T3rd細胞組成的異種移植物表現出顯著的腫瘤消退。用TMZ處理荷瘤小鼠，發現CircASAP1耗竭有效地恢復TMZ耐藥異種移植物對TMZ治療的敏感性，接受這種聯合治療的小鼠壽命延長。敲低circASAP1后Ki-67和NRAS的表達下降。

總結：
1. 鑒定在復發性膠質母細胞瘤組織樣本和TMZ耐藥細胞系中異常表達的circRNA——circASAP1。

2. CircASAP1通過NRAS/MEK1/ERK1/2信號促進腫瘤生長和TMZ耐藥。

參考文獻：

EIF4A3-induced circular RNA ASAP1(circASAP1) promotes tumorigenesis and temozolomide resistance of glioblastoma via NRAS/MEK1/ERK1/2 signaling （NEURO-ONCOLOGY，IF=10.247）

Yutian Wei#, Chenfei Lu#, Peng Zhou#, Lin Zhao#, Xiao Lyu, Jianxing Yin, ZhuMei Shi and Yong ping You