骨髓（BM）是神經母細胞瘤（NB）轉移的主要靶器官，其與患者預后差有關，然而，NB細胞入侵BM的機制在很大程度上是未知的。腫瘤微環境是腫瘤發展的關鍵因素，間充質基質細胞(MSCs)被認為是相關腫瘤基質的基本組成部分。本文發現從NB的BM受累者中分離出的BM-MSCs比從非浸潤性BM中分離出的MSCs具有更大的成骨潛能。本文于2020年7月發表在Journal of Extracellular Vesicles（IF:14.976）期刊上。

該文技術路線如下：

主要實驗結果如下：

1、NB和BM–轉移患者來源的BM-MSCs具有較強的成骨能力

提出假設：BM-MSCs在促進NB轉移中發揮重要作用。然后驗證假設，從12例感染NB的小孩和7例健康對照（HC）中分離得到BM-MSC細胞（Table 1）。與HC-MSCs類似，MBM-和NMBM-MSCs的CD90、CD105、CD81、CD9和GD2檢測為陽性，CD34、CD45、CD56為陰性(Figure 1(a))。增殖實驗顯示，NMBM-、MBM-和HC-MSCs具有相似的增殖能力。為了檢測成骨能力進行了組織染色和基因表達。茜素紅染色顯示，成骨誘導21天后，與NMBM-和HC-MSCs相比， MBM-MSCs中鈣離子釋放含量更高(Figure 1(c,d))，并且其成骨分化轉錄因子（RUNX2和OSTERIX）和成骨標志物（BMP2和SPP1）的表達也更高；而成脂分化則無顯著差異(Figure 1(e,f))。這些結果表明與無BM轉移患者分離的BM-MSCs相比，NB有BM浸潤患者分離的BM-MSCs具有更強的成骨分化能力。

圖1 MBM-MSCs具有增強的成骨潛能

2、BM轉移的NB細胞系產生的外泌體增強了HC-MSCs的成骨作用

將PKH26標記的外泌體與HC-MSCs細胞共培養，合成脂質體作為陰性對照。結果顯示，外泌體和脂質體都被HC-MSCs細胞內化(Figure 2(a,b)，隨后增強了HC-MSCs細胞中成骨基因的表達(Figure 2(c))。為了進一步探討外泌體對HC-MSCs細胞成骨表型的影響，觀察加了不同來源外泌與HC-MSCs細胞共培養后的鈣釋放情況。結果顯示，與IMR-32外泌體和脂質體相比，SH5YSY來源外泌體共培養的HC-MSCs細胞具有更多的鈣釋放含量(Figure 2(d,e))。此外，成骨標志物的表達不僅在成骨培養基中高表達在SH5YSY來源外泌體誘導組中也高表達(Figure 2(f,g))。這些結果表明BM轉移性來源的NB細胞的外泌體在調節BM-MSCs的成骨分化中扮演著重要的作用。

圖2 從MBM細胞中分離的外泌體可誘導HC-MSCs的成骨分化

3、MiR-375在從BM -轉移來源的NB細胞系釋放的外泌體和MBM-MSCs中高表達

如圖3所示，對7中細胞系來源的外泌體中miRNA進行表征，結果發現外泌體miR-375的表達在PT來源的細胞系和BM來源的細胞系之間存在差異，miR-375顯著高表達，在BM -轉移來源的NB細胞系更是顯著上調。

圖3 外泌體miR-375的表達在PT來源的細胞系和BM來源的細胞系之間存在差異

隨后，靶基因預測發現YAP1和DEPTOR是miR-375的靶基因(Figure 4(a))，其表達水平在NB細胞系中存在差異，與PT來源細胞系相比，在NB BM轉移細胞中顯著低表達，而相比于IMR32IGR-NB8，YAP1蛋白和YAP1-p幾乎不在NB BM轉移細胞中表達(Figure 4(b-c))。此外，經過SH5YSY來源外泌體處理過的HC-MSCs細胞中YAP1和DEPTOR的表達都顯著上調了(Figure 4(f-g))。這種miR-375靶基因表達的可變性可能與樣本數量少有關也可能與參與其中的分子途徑有關。

圖4 從SHSY5Y中分離的外泌體下調了YAP1和DEPTOR這兩個miR-375的靶基因

4、miR-375調節成骨轉錄因子的表達

作者首先檢測了NMBM-MSCs細胞中轉染miR-375后24h-96h不同時段的miR-375的表達和靶基因YAP1和DEPTOR表達。如預期的，miR-375的表達升高，YAP1和DEPTOR的表達下降，此外，成骨標志物SPP1和OSTERIX的表達也升高了(Figure 5(a-d))。與此相反的，轉染miR-375 抑制劑后得到的效果與上述完全相反(Figure 5(e-g))。總之，在NMBM-MSCs中，miR-375過表達可誘導成骨基因的轉錄。

圖5 在NMBM-MSCs中，miR-375過表達可誘導成骨基因的轉錄

5、MiR-375表達水平與NB患者的BM疾病相關

為了檢測miR-375表達水平與NB患者的BM浸潤的相關性，檢測了有無BM浸潤的患者中miR-375的表達，結果顯示MBM患者及其外泌體中的miR-375表達均顯著高于NMBM患者 (Figure 6(a-b))。為了評估miR-375在BM細胞中的表達，進行了27例NMBM患者和33例MNM患者的石蠟包埋BM樣本的ISH染色。而突觸素染色用于評估NB侵襲。染色強度miR-375無表達記0分，低表達1分，高表達記2分，如圖Figure 6(c)。結果顯示，1分和2分顯著與BM浸潤患者相關(Figure 6(d,e))。miR-375在MBM患者中的表達不僅存在于神經原細胞中，也存在于成骨細胞和BM的其他原生細胞中(Figure 6(f))。Figure 6(g)表明PKH26標記的SHSY5Y來源外泌體可以被BM細胞吸收，并且可以轉運攜帶的miR-375(Figure 6(h-i))。這些結果表明循環外泌體和BM中高水平的miR-375與BM的轉移有關。

圖6 NB患者中MiR-375的表達與BM疾病相關

總之，本文發現在與骨NB來源的外泌體共培養后，miR-375在MBM-MSCs和HC-MSCs中的表達水平升高。基于這些結果，作者進一步發現miR-375可能通過外泌體從BM型NB細胞轉移到間充質干細胞，促進成骨分化，并為轉移生長創造有利的微環境(Figure6(f))。

參考文獻：

Colletti Marta., Tomao Luigi., Galardi Angela., Paolini Alessandro., Di Paolo Virginia., De Stefanis Cristiano., Mascio Paolo., Nazio Francesca., Petrini Stefania., Castellano Aurora., Russo Ida., Caruso Roberta., Piga Simone., De Vito Rita., Pascucci Luisa., Peinado Hector., Masotti Andrea., Locatelli Franco., Di Giannatale Angela.(2020). Neuroblastoma-secreted exosomes carrying miR-375 promote osteogenic differentiation of bone-marrow mesenchymal stromal cells. J Extracell Vesicles, 9(1), 1774144. doi:10.1080/20013078.2020.1774144