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Blood|人類紅白血病遺傳學和轉錄組鑒定主轉錄因子為功能性疾病驅動因子

欄目:最新研究動態 發布時間:2020-11-10
急性紅白血病(AML-M6或AEL)是一種罕見但侵襲性的血液惡性腫瘤。既往研究表明,AEL白血病細胞經常攜帶復雜的核型和已知aml相關癌基因的突變...

     急性紅白血病(AML-M6或AEL)是一種罕見但侵襲性的血液惡性腫瘤。既往研究表明,AEL白血病細胞經常攜帶復雜的核型和已知aml相關癌基因的突變。為了更好地定義驅動紅細胞表型的潛在分子機制,我們研究了一系列33個AEL樣本,它們代表三個遺傳AEL亞群,包括TP53突變、表觀調控突變(如DNMT3A、TET2或IDH2),以及低突變負荷的未定義病例。我們建立了一個基于紅髓轉錄組的空間,獨立于分子亞群之外,大部分AEL樣本表現出獨特的圖譜,不同于非m6 AML和骨髓增生異常綜合征樣本。值得注意的是,超過25%的AEL患者,包括在基因不明確的亞組中,顯示了關鍵轉錄調節因子的異常表達,包括SKI、ERG和ETO2。這些因子在小鼠紅系祖細胞中的異位表達阻斷了體外紅系分化并導致永生化,進而導致GATA1結合位點染色質可及性降低和對GATA1活性的功能干擾。體內模型顯示了致命紅血球、混合紅血球/髓系或其他惡性腫瘤的發展,取決于表達ael相關改變的細胞群。總的來說,我們的數據表明,AEL是一種具有紅細胞特性的分子異質性疾病,其部分原因是造血干細胞或祖細胞中關鍵的紅細胞轉錄因子的異常活動。

技術路線:

背景:
     紅系的急性髓系白血病(AML)(紅細胞白血病,AML- m6或AEL)占AML患者的3-5%,與不良預后有內在聯系。雖然AEL可以發生在任何年齡,但大多數患者都是65歲,該病通常繼發于其他腫瘤,包括骨髓增生腫瘤(MPN)或骨髓增生異常綜合征(MDS),或在細胞毒性癌癥治療后發生。兩種主要的形態學亞型已被提出:純紅白血病(PEL, AML-M6b,又稱Di Giuglielmo病),80%的細胞屬于紅系;以及AML- M6a,其特征是紅細胞前體和髓細胞同時存在。2016年世衛組織分型將AML- m6a納入骨髓增生異常綜合征(MDS)或非特異性AML (AML- nos),但該分型仍存在爭議。
     功能研究表明,在HSPC預先發生改變的背景下,2-5個基因驅動病變可能足以誘發AML。對于AEL,早期的工作表明白血病細胞通常有復雜的核型,并且靶向DNA測序揭示了幾個已知的aml相關突變的存在,但是AEL驅動的分子機制仍然不完全了解,并且紅血病特異性突變很少得到功能上的驗證。引人注目的是,單個或多個TP53突變已被證明是PEL的分子特征。
     正常的紅細胞分化是由兩種外部信號因子控制的,包括通過EPOR信號通路介導其作用的促紅細胞生成素(EPO)和內在的多聚體轉錄復合物。后者包括造血主監管機構如GATA-binding蛋白1 (GATA1), t細胞急性淋巴細胞白血病蛋白1 (TAL1), LIM領域僅2 (LMO2) CBFA2 / RUNX1伙伴轉錄體若3 (CBFA2T3,也稱為ETO2)和LIM-domain-binding蛋白1 (LDB1),此后一般叫“GATA1-復合物”,可以激活或抑制靶基因的轉錄。這些GATA復合物通過與重要紅細胞基因(如血紅蛋白)的基因位點結合和轉錄,促進終末紅細胞的分化。
結果:
一、AEL患者的分子改變

     我們收集了58例AEL患者的樣本,包括34例60歲的成人,14例40-59歲,8例青壯年(21-39歲)和2例兒科患者。根據2008年世衛組織分類、33例診斷為新創AEL,包括29 AML-M6a 349和4 AML-M6b, 20名患者被診斷出患有AML-M6a次要MDS / CML, 1 AML-M6b二級脈絡叢癌和一個更精確的診斷缺乏4例(補充圖1 a和補充表3)。
     此后,所有患者都使用了AEL一詞。一些AEL樣本缺乏足夠數量的活細胞,通過異種移植來擴大他們在NOD。Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl / SzJ (NSG)老鼠。
     這種方法提供了額外的白血病材料分離RNA(7例)和DNA(4例)。從33名患者獲得了測序材料,并對11對白血病和非腫瘤性(來自同一患者的CD3+或CD19+細胞)樣本進行外顯子組測序,并對29個白血病樣本進行rna測序。
     結合外顯子組和RNA-seq數據,我們在62個基因中鑒定了序列變異,預測了359個功能后果。
     出現TP53突變的亞群-1(占36.3%的患者)每個樣本平均有4.41個突變,與較高的細胞遺傳風險和較差的結果相關。
     亞組3 (n= 10,30.4%)的樣本中沒有TP53或表觀遺傳變異。平均而言,這些AEL在每個樣本中顯示1.60個突變,顯著低于亞組-1和2。
二、AEL基因表達特征與紅細胞分化相關

     由于異質遺傳改變不能為這些白血病的紅系表型提供任何強有力的理論依據,我們通過比較基因表達標記(GES)來研究紅系特征。主成分分析(PCA)沒有顯示GES和之前鑒定的三個分子亞群之間有任何顯著的相關性(圖2A)。同樣,診斷時患者BM中的紅細胞百分比在GES中反映不佳(圖2B)
     為了進一步探討AEL轉錄組與人類紅細胞不同成熟階段的關系,在將人外周血單核細胞體外分化為集落形成單位紅細胞(“CFU-E”,CD71+CD235-)、前紅細胞(“Pro-E”,CD71+CD235low)、中紅細胞(“Int-E”,CD71+CD235high)和晚期紅細胞(“late -e”,CD71lowCD235high)后,我們比較了患者的GES和那些通過實驗獲得的GES并根據這些成熟階段觀察到聚類(圖2C-D)。重要的是,來自一個獨立的更大的AEL患者隊列36的轉錄組相似地聚集在一起(圖2E-F)。
     總之,AEL基因表達程序受紅細胞分化階段的影響,而不是受特定基因病變的影響,表明人類AEL中紅細胞的同一性與細胞起源和驅動細胞分化的轉錄調節活性有關。
三、基于轉錄組的空間映射AEL, MDS和其他AML到紅系和髓系的譜系軌跡

     我們從DMAP數據庫中檢索細胞特征并計算紅細胞和髓系分化表達軌跡(Figure 3A)。與預期的一樣,相對差異的基因表達聚集在我們的AEL樣本之間的紅髓軌跡。大多數病例(n=25)靠近紅系軸,而其余病例(n=7)靠近髓系軌跡,更接近MDS轉錄組(圖3B-C)。同樣,來自最近發表的一個大型AEL組36的樣本,除了MDS樣本(圖3C)和非m6 AML樣本41(圖3D)外,也大多聚集在一起。
     值得注意的是,AEL樣本大多預測在造血干細胞和成熟紅細胞之間,支持只有部分成熟相關紅細胞程序在這些樣本中表達。有趣的是,在我們AEL樣本映射靠近髓軸和其他AML樣本,樣本# 24顯示高表達SPI1(圖2圖3 d,補充b)也出現在其他AML亞型和實際上是由臨床醫生重新歸類為AML-M5獨立的過程中。有趣的是,我們觀察到,紅細胞轉錄因子(如KLF1、GATA1、NFE2、TAL1、NFIA)的表達逐漸下降,并預測其活性從紅細胞向髓系軌跡轉移,且與髓系因子(如CEPBA和SPI1)因子呈負相關(圖3E和補充圖3C)。我們觀察到一些AEL患者確實表達了異常高水平的ERG (n=2)、GFI1 (n=1)、RUNX1T1(=1)和ETO2 (n=1)(圖3F)。
四、AEL相關的gata1干擾因子過表達可轉化小鼠紅細胞祖細胞

     為了從功能上檢測在AEL樣本中發現的gata1干擾因子的異常表達是否有助于紅細胞系的轉變,我們探討了SKI、ERG、ETO2、GATA1s、EPO、SPI1和B4GALNT3的異位表達對小鼠紅細胞祖細胞的影響。
     將經facs純化的試劑盒+CD71+Ter119+細胞轉染編碼這些基因的逆轉錄病毒,在體外培養(圖4A)。
     只與vector-transduced控制擴散~ 7天,ERG的異位表達,SPI1, ETO2,滑雪,和B4GALNT3明顯保持紅細胞細胞擴散呈現一個不成熟CD71 +設備+ Ter119 -表型和pro-erythroblast形態在30天內(圖4圖5 b和補充)。
     雖然在這種情況下,將在人類AEL樣本中觀察到的過表達水平與在小鼠模型中觀察到的過表達水平進行精確比較在技術上具有挑戰性,但在ERG、ETO2、SKI和B4GALNT3中觀察到類似的過表達范圍(補充圖5B)。值得注意的是,僅EPO或GATA1s的異位表達不足以使成紅細胞擴張超過10天(圖4B)。
     為了解決tet2失活和Gata1s突變之間的合作是否能在體外轉化成紅細胞,我們從野生型、Tet2-缺陷(Tet2-/-)、Gata1 e2敲入(Gata1s)和雙Tet2-/-+Gata1s轉基因小鼠中純化紅系祖細胞,比較其增殖情況(圖4C)。只有Gata1s-或Tet2-/-的紅細胞在10-15天內沒有擴張,而Tet2-/-+Gata1s紅細胞增殖超過2個月,呈現紅樣形態(圖4D和補充圖5C)。
     此外,異常表達的AEL相關轉錄調節因子干擾了GATA1染色質的可及性和功能。
五、AEL相關變化之間的功能協作的體內模型

     為了解決功能合作問題,我們將Tet2-/-+Gata1s Lin- HSPC移植到致死輻照受體中(圖5A)。與只接受Tet2-/-細胞的受體不同,接受Tet2-/-+Gata1s細胞的受體出現了一種快速、完全滲透的致命疾病,并伴有高WBC、貧血、血小板減少和脾腫大(圖5B-C和補充圖7B)。流式細胞儀分析顯示,白血病細胞主要為CD11b+Gr1+髓系細胞(圖5D),組織病理學分析證實,骨髓和脾臟中有大量髓系細胞浸潤(補充圖7C)。
     我們通過將從一次受體獲得的純化的ERG轉染(GFP+)野生型或TP53R248Q紅母細胞移植到二次受體,評估了特別是在紅系祖細胞中ERG高表達的長期后果(圖5E)。
     AEL相關的TP53改變大多與其他表觀基因組異常有關,包括轉錄因子ERG的異常表達。所有接受過表達ERG的TP53R248Q紅細胞均發生致命白血病,中位生存期為60天,而接受表達ERG的野生型紅細胞在4個月后發生疾病。(圖3F)。
     TP53R248Q+ erg誘導的疾病以貧血、血小板減少(圖5G)、CD71+Ter119+紅血球和少量CD11b+Gr1+髓系祖細胞在BM中積累為特征(圖5H),并浸潤脾臟和肝臟(補充圖7F)。
六、SKI表達異常引起紅細胞轉化的體內建模

     為了研究SKI的轉化活性是否依賴于造血靶細胞,我們純化、轉導和移植了長期的多能造血干細胞、紅細胞- nriched (MEP)或骨髓承諾粒細胞-巨噬細胞(GMP)祖細胞(圖6A)。移植后3周,所有組的血液中都能檢測到轉導細胞,但僅在ski -轉導的HSC和MEP受體的骨髓移植中觀察到。隨后出現以貧血、血小板減少為特征的癥狀性疾病(補充圖8H),同時表現為CD11b+Gr1+髓系和CD71+Ter119+紅系特征(圖6B-E)。ski -介導的GMP受體沒有發生疾病。有癥狀的HSC或MEP受體顯示嗜堿性、嗜多色和原色紅細胞增多,網織紅細胞增多,成熟紅細胞相對減少(圖6F),表明SKI延遲但不完全阻止體內紅細胞分化。組織病理學分析證實了BM細胞過度增生,并顯示在脾臟和肝臟中有紅細胞浸潤(圖6G和補充8I)。