溶酶體是至關重要的細胞器，負責降解蛋白質和受損細胞器以維持細胞穩(wěn)態(tài)。轉錄因子EB（TFEB）是調節(jié)溶酶體生物發(fā)生和自噬的主要轉錄因子。TFEB在細胞核中的功能是精細調節(jié)的，MiRNA是否參與TFEB的精密調節(jié)功能，今日揭曉答案。

技術路線:

結果:
1. 篩選與CLEAR結合的候選miRNA
    為調查核miRNA是否調節(jié)TFEB依賴的轉錄調節(jié)，將來自HEK293細胞的核RNA與含有TFEB的結合基序-CLEAR元素的DNA片段共孵育，通過下拉測定，TFEB與CLEAR元素結合。RNA測序檢測下拉的核miRNA，并結合熒光素酶報告基因鑒定出miR-30b-5p使CLEAR熒光素酶報告基因活性減少46％，在溶酶體生物發(fā)生基因的啟動子上觀察到與miR-30b-5p互補的基序。通過FRET分析驗證miR-30b-5p和CTSD基因的DNA啟動子片段之間的直接互動。總而言之，新型miRNA miR-30b-5p可以與CLEAR結合，抑制轉錄激活。

2. MiR-30b-5p抑制含有CLEAR元素基因的反式激活
    FISH檢測顯示miR-30b-5p位于細胞質和核。在miR-30b-5p敲除HEK293細胞中，TFEB在CLCN7，MCOLN1，CTSD和GLA 4個基因啟動子片段上的富集增加，含有CLEAR元素的基因（例如CTSA，CTSD，MCOLN1和LAMP2）的活性在miR-30b-5p轉染的細胞中減少，含有CLEAR元素的基因的mRNA水平在轉染miR-30b-5p細胞中顯著降低。si-Importin8介導成熟miRNA的細胞質至細胞核轉運，導致核miR-30b-5p水平降低88％和miR-30b-5p對上述基因mRNA表達的抑制作用消失。這些結果證實miR-30b-5p抑制了細胞核中含CLEAR元件基因的轉錄激活。

3. 過表達miR-30b-5p抑制溶酶體生物發(fā)生與自噬
    TFEB是調節(jié)溶酶體生物發(fā)生和自噬的主要轉錄因子。轉染miR-30b-5p的HEK293細胞中溶酶體發(fā)生相關基因的表達被抑制，miR-30b-5p能減少營養(yǎng)剝奪或Torin1處理的溶酶體基因蛋白質水平的增加。miR-30b-5p降低了經(jīng)典的溶酶體標記基因LAMP1和Lysotracker的熒光強度。這些結果表明過表達miR-30b-5p抑制了溶酶體的生物發(fā)生。溶酶體生物發(fā)生是自噬溶酶體途徑中不可缺少的一個過程，TFEB也調節(jié)自噬相關基因的表達。與巴氟霉素A1共處理，miR-30b-5p轉染的細胞LC3-II水平降低，miR-30b-5p可抑制自噬體和溶酶體的融合。以上表明miR-30b-5p抑制了自噬體的生物發(fā)生，以及自噬體-溶酶體融合。

4. 敲除內源性miR-30b-5p升高溶酶體生物發(fā)生和自噬
    溶酶體生物發(fā)生和自噬基因的蛋白質水平在miR-30b-5p基因敲除HEK293中上調，與EBSS或Bafilomycin A1共使用時，上述基因的增加更為顯著。LAMP1和Lysotracker以及串聯(lián)EGFP-mCherry-LC3探針證實了內源性miR-30b-5p和自噬溶酶體過程之間的關系。

5. miR-30b-5p對溶酶體過程和自噬的抑制作用依賴TFEB
    Mut-miR-30b-5p（CLEAR的潛在結合位點被突變）逆轉了miR-30b-5p對TFEB轉錄活性的抑制作用。此外，溶酶體和自噬相關基因的mRNA和蛋白質水平不受Mut-miR-30b-5p影響。miR-30b-5p過表達細胞中，抑制TFEB挽救了溶酶體和自噬相關基因的螢光素酶活性和mRNA水平的降低，TFEB的過表達可以部分挽救miR-30b-5p的上述抑制作用。這些數(shù)據(jù)表明，TFEB對miR-30b-5p介導的溶酶體生物和自噬的抑制是必不可少的。

6. miR-30b-5p對小鼠肝臟自噬溶酶體過程的調控
    進一步探索miR-30b-5p在體內的功能，通過尾靜脈將重組腺病毒注射到小鼠中，禁食48小時以誘導小鼠肝臟中溶酶體生物發(fā)生和自噬，在肝臟中證實過表達成熟的miR-30b-5p，導致TFEB和溶酶體生物發(fā)生基因的啟動子pol II的富集減少，LAMP1和LC3-II蛋白降低，SQSTM1 / p62蛋白增加。這些結果顯示miR-30b-5p抑制了饑餓引起的自噬溶酶體過程。