衰老是時間賜予所有生物不可拒絕的禮物，但是這個過程是如何完成的卻一直困擾著科學家們。本文使用單細胞轉錄組測序為衰老的到來提供了見解，并于2020年6月15日發表于《Nature》。
    衰老過程中細胞會逐漸喪失生理完整性，導致功能受損和死亡易感性增加。為了更好地了解這些過程，作者構建了小家鼠整個壽命期的單細胞轉錄組圖譜，其中包括來自23個組織和器官的，超過350000個細胞的單細胞測序數據，這些細胞來自雄性和雌性C57BL/6JN小鼠的6個年齡段，從1一個月到30個月（圖1a）。用于單細胞的器官有膀胱，骨髓，大腦（小腦，皮質，海馬和紋狀體），脂肪（棕色，性腺，腸系膜和皮下），心臟和主動脈，腎臟，大腸，肢體肌肉和膈肌，肝，肺，乳腺，胰腺， 皮膚，脾臟，胸腺，舌頭和氣管。
    采用微流體滴法(droplet)技術收集所有組織和器官的6個年齡組的數據；3個月，18個月和24個月的時間點也用微孔板的單細胞分選技術(熒光活化細胞分選，FACS)。來自3月齡小鼠的數據占整個數據集中約20％的細胞，并用作其他時間點對數據執行細胞類型注釋的基礎（圖1b）。使用這種方法，能夠自動注釋超過70%的細胞。使用無偏差的方法對注釋校正后的細胞聚類（圖1c，d），并評估在相同聚類中相似注釋的同時出現的細胞。例如，注解為B細胞或內皮細胞的細胞傾向于占據相同的簇，而不論其來源組織或處理方法（圖1e，f）。

圖1 Tabula Muris Senis總覽

    單細胞測序有可能在特殊的細胞類型中發現與年齡相關的變化，并且單細胞數據使我們能夠了解在大量實驗中觀察到的基因表達變化是由于群體中每個細胞的基因表達變化引起的，還是每個細胞的基因表達保持不變而該類型的細胞數量發生變化，或者兩者都有引起的。作者觀察到，在多種情況下，基因的改變是兩者都有的。于是，作為代表性的例子，作者研究了表達Cdkn2a的細胞隨年齡變化的趨勢。Cdkn2a及其蛋白產物p16的表達是最常用的衰老標記之一，也是衰老的重要標志。根據FACS (Fig. 2a)和液滴(Fig. 2b)方法的分析，年老小鼠中表達Cdkn2a的細胞比例比年輕小鼠高出一倍以上，這伴隨著p16蛋白水平的兩倍的增長(Fig. 2c-d)。值得注意的是，在30個月大的小鼠中，表達p16的細胞比例比24個月大的小鼠要小，這可能是因為長壽的動物衰老速度較慢。
    每種組織類型的細胞組成往往隨年齡而變化。由于分離對組織中所有細胞類型的影響并不相同，因此，相對于比較不同細胞類型在同一年齡的比例，特定細胞類型的相對組成隨年齡的變化更有意義。隨著年齡的增長，膀胱細胞類型的組成發生了明顯的變化(圖2e) ：然而，該組織的間充質間室在小鼠的一生中減少了三倍(圖2e，左)，尿路上皮間室增加了相似的數量(圖2e，右)。利用差異基因表達分析評估組織隨年齡的整體變化，我們發現基質相關基因(Col1a1、Col1a2、Col3a1和Dcn)下調，而上皮相關基因(Krt15、Krt18和Sfn)上調(圖2f)。內皮細胞數量的下降表明，小鼠膀胱老化可能與較低的器官血管化有關，這與最近的發現以及觀察到的血管相關基因的下調是一致的Htra1和Fos(圖2f)。白細胞數量的增加可能表明存在炎性組織微環境，這是衰老的常見標志，與膀胱過度活動癥的文獻一致，并且整個組織中Lgals3，Igfbp2和Ly6d的顯著過表達也支持這種情況（圖2f），以及膀胱（間充質）細胞和膀胱尿路上皮細胞中與免疫反應相關的基因（例如Tnfrsf12a和Cdkn1a）的過表達。此外，在不同年齡段進行比較時，我們發現白細胞中促炎性標記物（例如Cd14，Lgals3和Tnfrsf12a）的表達增加，而抗炎性標記物（例如Cd9和Cd81）的表達減少。
    年齡相關的腎臟變化包括系膜細胞、毛細血管內皮細胞、亨利升肢環上皮細胞和亨利增厚升肢環上皮細胞相對豐度的減少(圖2g)。系膜細胞和毛細血管內皮細胞都是腎小球的核心細胞，它們的相對豐度隨著年齡的增長而減少(圖2g，上)，同時組織范圍內減少Egf和Atp1a1表達(圖2h)——提示腎小球濾過率受損。值得注意的是，在毛細血管內皮細胞和系膜細胞中，局部Atp1a1的表達均隨年齡增長而增加，這表明有一種補償機制抵消了這些細胞隨年齡增長比例下降的影響。差異基因表達分析的結果表明，umod(編碼尿調蛋白，尿蛋白中最豐富的蛋白)的表達也在整個組織中減少。尿調節蛋白是由排列在髓袢升支粗段的上皮細胞產生的，因此，鑒于其上皮細胞比例的相對降低，表明正常的腎功能受損 (圖2g圖2h）。與Atp1a1一樣，Umod的表達在細胞類型中增加，而這種細胞類型隨著年齡的增長而變得越來越少，導致其在器官中的表達整體減少。
    在脾臟，T細胞的比例隨著年齡的增長而減少，而漿細胞的相對數量增加(圖2i)。通過B細胞和漿細胞標記基因Cd79a和Jchain(也稱為Igj)，和Cd3d的下調展現(圖2j)。同樣，在乳腺中，也觀察到T細胞數量的下降。年齡相關的T細胞數量減少與感染性疾病和癌癥的風險增加有關，本文的結果表明，這種減少也可能發生在脾臟和乳腺。附圖5中例述了乳腺T細胞和前體B細胞，皮膚干細胞的變化及基因表達差異。此外，基因編碼AP1轉錄因子（Junb, Jund and Fos）隨年齡增長時上調。

圖2 衰老中的細胞類型的改變

    基因組不穩定性是最廣泛研究的老化特征之一，全長轉錄數據使分析體細胞突變隨年齡的積累成為可能。使用基因組分析工具kit39在所有FACS樣本中同時識別單核苷酸多態性。本文關注的是在特定組織中，每個年齡組至少75%的細胞中表達的基因，并觀察到在我們分析的所有器官中，與年齡相關的突變數量增加(圖3)舌頭和膀胱受影響最嚴重。對測序覆蓋范圍和基因表達水平進行控制，并驗證了突變的數量超過了擴增和測序錯誤的預期，(圖3)。盡管很難從轉錄組中推斷出全基因組的絕對突變率，但由于各種原因，轉錄組會夸大表觀突變率，因而我們觀察到的趨勢是對突變頻率和基因組穩定性的有用的間接估計。

圖3 老化小鼠組織中的突變負擔

    衰老也會影響免疫系統，所以分析了整個機體B細胞和T細胞之間的克隆關系。分別使用singlecell-ige和示蹤劑對FACS數據中出現的B細胞和T細胞受體的序列進行了計算重建。B細胞受體是6,050個細胞組裝(圖4a)，T細胞受體是6,000個細胞組裝(圖4b) 。在3個月大的老鼠中，裝配B細胞受體的細胞數量為1818個，18個月大的老鼠為1356個，24個月大的老鼠為2876個。對于B細胞和T細胞庫的克隆性變化表明24個月大小鼠的免疫系統對新病原體的反應可能性較小。這證實了文獻報道，與年輕的個體相比，年長的個體對新感染的脆弱性更高，而接種疫苗的收益則更低。
    最后，計算了總體多樣性評分，以確定哪些細胞類型更容易隨年齡變化。觀察到源自大腦和腎臟的免疫系統細胞多樣性的顯著變化（圖4c）。在腦髓系小膠質細胞中，3個月大的年輕小膠質細胞聚類1和6，而18個月大的和24個月大的小膠質細胞絕大多數聚類10，14，12(圖4d)。軌跡分析表明，年輕的小膠質細胞在獲得老的小膠質細胞的特征之前，會經歷一個中間狀態，即以18個月大的小膠質細胞為主的集群為代表。聚類10、12和14主要包含18個月和24個月的小膠質細胞。這些細胞上調主要的組織相容性復合體（MHC）I類基因（H2-D1，H2-K1和B2m）以及與變性疾病相關的基因（例如Fth1）。與群集1和6（主要包含3個月的小膠質細胞）進行比較時，群集10、12和14中的基因表達富含干擾素反應性或調節性基因（例如Oasl2，Oas1a，Ifit3，Rtp4，Bst2，Stat1，Irf7 ，Ifitm3，Usp18，Ifi204和Ifit2），提示該小膠質細胞在促炎亞型的小鼠衰老的大腦中增加了。

圖4 衰老中的免疫系統圖

    此外，“年輕”和“老”簇之間差異表達基因的列表類似于先前報道的阿爾茨海默氏病特異性小膠質細胞信號，在兩個差異基因表達列表之間的前200個差異表達基因中有55個相同（圖4e）。關于腎臟巨噬細胞，我們發現了兩個簇，其組成隨年齡顯著變化。聚類10主要由1個月大和3個月大的小鼠細胞組成，而聚類13主要由18個月大，21個月大，24個月和30個月大的細胞組成。老年小鼠（圖4f）。基因表達差異顯示簇10富含M2巨噬細胞基因標志物（例如Il10，H2-Eb1，H2-Ab1，H2-Aa，Cd74，C1qa，Cxcl16，Hexb，Cd81，C1qb和Cd72）。簇13細胞類似于M1促炎性巨噬細胞狀態，（例如，Hp，Itgal，Msrb1和Gngt2）（擴展數據圖11f，補充表10）。

補充圖11f. 第10群(主要是年輕巨噬細胞)與第13群(主要是老巨噬細胞)差異基因表達分析的熱圖

    總之，本文獲得的“單細胞小鼠衰老細胞圖集”，作者也稱之為“Tabula Muris Senis”，它是細胞生物學界的綜合資源，它提供了詳細的分子和細胞類型特定的衰老肖像。這樣的細胞圖譜是基因組必不可少的伴侶：基因組提供了生物體的藍圖，但沒有解釋基因是如何以細胞類型特定的方式使用的，也沒有解釋基因的使用在生物體的整個生命周期中是如何變化的。細胞圖譜提供了表型和生理學的深層特征，并為理解哺乳動物在其生命周期中發生的細胞生物學變化的許多方面提供了參考。
參考文獻：
Tabula Muris Consortium.(2020). A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse. Nature, 583(7817), 590-595. doi:10.1038/s41586-020-2496-1