結直腸癌(CRC)是全球癌癥相關死亡的主要原因。外泌體是細胞間通信的重要調節因子，外泌體中豐富的circRNA。circRNA是調控腫瘤增殖和進展的非編碼RNA的一部分。然而，癌源性外泌體circRNA在CRC中的作用及調控機制尚不清楚。上海同濟大學醫學院的商安全等人在Molecular Cancer（IF=15.302）這一雜志發表文章介紹circPACRGL在調節結腸癌中的作用。

技術路線圖：

研究結果：

1.CRC來源的外泌體增強CRC增殖、遷移和侵襲

    為了探討外泌體在CRC中的作用機制，從HCT116和SW480細胞上清中分離出外泌體。通過透射電子顯微鏡和納米粒子跟蹤分析(NTA)方法發現圓形粒子是80-100nm的雙層膜，符合外泌體大小(圖1 a和b)。WB檢測外泌體特征標記物（CD9, CD54，Annexin，GM130）的表達，驗證提取到的是外泌體。CCK8檢測顯示外泌體顯著增強了CRC細胞的增殖(圖1d)。流式細胞術分析顯示CRC細胞的凋亡細胞百分比明顯降低(圖1e)。此外，傷口愈合和transwell表明,液從CRC細胞的外泌體能顯著促進CRC的遷移和侵襲(圖1 f和g)。此外,WB結果表明CRC來源的外泌體增加BCL-2, N-cadherin, Vimentin,和MMP9的表達，減少reduced E-cadherin,Cleaved-caspase3, Cleaved-caspase9 蛋白的表達(圖1 h)。裸鼠尾靜脈注射外泌體處理的-HCT1 116 -熒光素酶標記的細胞，體內成像系統監測發現外泌體處理顯著增加了HCT116細胞的轉移。結果表明CRC來源的外泌體促進CRC增殖、遷移和侵襲。

2.腫瘤來源外泌體處理的CRC細胞中circPACRGL顯著上調

    報道顯示circRNAs在腫瘤來源的外泌體中富集。我們分析了三對外泌體刺激的HCT116和SW480的表達譜，和未處理細胞的RNA測序來識別與CRC相關的circRNA(圖2a)。SW480和HCT116的差異表達由Venn圖顯示。circPAGRAL(circ-0069313)是兩組中表達上調最多的基因(圖2b)，并通過RT-qPCR驗證(圖2c)。外泌體刺激的CRC細胞中circPAGRAL水平持續且顯著升高(圖2c)。這與CRC細胞中使用CRC患者血清來源外泌體處理的結果不一致(圖2d)。我們進一步從CRC患者的腫瘤組織中分離出外泌體。qRT-PCR結果顯示，circPAGRAL在經腫瘤來源外泌體處理的CRC細胞中表達顯著上調(圖2e)。這些結果表明在腫瘤來源外泌體刺激的CRC細胞中circPACRGL顯著升高，circPACRGL可能來源于腫瘤來源的外泌體。

    RT-qPCR檢測驗證了在HCT116和SW480細胞中circPACRGL沉默導致其表達明顯降低(圖2f)。與腫瘤來源的外泌體共培養后，兩種CRC細胞中circPACRGL mRNA表達顯著升高(圖2g)。這些結果表明circPACRGL主要來源于腫瘤來源的外泌體，而不是來源于腫瘤細胞內的表型變化。

3.circPACRGL作為miR-142-3p和mir-506-3p的海綿

    在細胞質中，許多證據表明circRNA的調控機制是作為miRNA海綿。FISH熒光原位雜交結果顯示，circPACRGL轉錄信號主要分布在HCT116和SW480細胞的細胞質中(圖3a)。在線生物信息學數據庫StarBase 2.0分析circPACRGL靶miRNA，發現circPACRGL同時具有miR-142-3p和miR-506-3p的結合位點(圖3b)。雙熒光素酶報告基因實驗進一步證實miR-142-3p和miR-506-3p是circPACRGL的靶點。與miR-NC相比，circPACRG -wt和細胞共轉染miR-142-3p/miR-506-3p mimics，熒光素酶活性明顯下降。同時，細胞miR-142-3p和miR-506-3p mimics和circPACRGL-mut顯示熒光素酶活性變化小(圖3 c)。此外,我們發現CRC來源的外泌體刺激的HCT116和SW480細胞miR-142-3p/miR-506-3p表達顯著減少(圖3 d)。這些結果表明circPACRGL可以作為miR-142-3p和miR-506-3p的海綿。

4.TGF-β1是miR-142-3p/miR-506-3p的共同靶點

    MiRNAs可與調控mRNA和蛋白表達的基因3′UTR結合。在線生物信息學工具StarBase 2.0預測miR-142-3p和miR-506-3p的靶基因,發現了TGF-β1。有報道TGF-β1參與腫瘤的發生發展，并與N1/N2中性粒細胞的分化相關。熒光素酶報告基因檢測，證實TGF-β1是miR-142-3p和miR-506-3p共同的靶基因(圖4a和b)。HEK293T細胞在共轉染miR-142-3p/miR-506-3p mimics和TGF-β1-wt后熒光素酶活性明顯降低。然而，miR-142-3p/miR-506-3p-mut挽救了這種抑制(圖4b)。WB和qPCR進一步表明，miR-142-3p/miR-506-3p mimics 轉染顯著降低TGF-β1的蛋白質和mRNA水平(圖4 c和d)。

    在外泌體處理的CRC細胞中，TGF-β1蛋白質和mRNA水平顯著增加；而在與miR-142-3p/miR-506-3p抑制劑共培養之后，這種上調作用顯著的抑制(圖4 e和f)。研究表明, TGF-β1是miR-142-3p/miR-506-3p的一種常見靶標。

5.circPACRGL通過調控miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1，促進CRC增殖、遷移和侵襲

    CCK8結果顯示，與對照組相比，經CRC來源的外泌體處理之后CRC細胞的增殖能力明顯提高(圖5a)。下調circPACRGL可顯著降低CRC細胞的增殖，而在miR-142-3p/miR-506-3p 抑制劑處理或TGF-β1過表達后，這種抑制作用減弱(圖5a)。外泌體刺激的CRC細胞的凋亡細胞比例降低。下調circPACRGL可促進CRC細胞凋亡，但這種增強作用被外泌體刺激所抑制。miR-142-3p/miR-506-3p 抑制劑處理或TGF-β1過表達后，CRC細胞的凋亡率顯著降低(圖5b)。傷口愈合和transwell表明，CRC來源外泌體提高CRC細胞遷移和入侵的能力；circPACRGL敲除后，作用相反(圖5 c和d)。結果證實circPACRGL通過調控miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1促進CRC增殖、遷移和侵襲。

6.CRC來源的外泌體circPACRGL通過miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1調控N1-N2中性粒細胞的分化

    研究報道顯示高水平的TGF-β1與腫瘤的發生，N1中性粒細胞向N2中性粒細胞表型轉換有關，而N2中性粒細胞可促進腫瘤增殖和轉移。我們探討了CRC來源的外泌體 circPACRGL是否也可以通過這個軸調控中性粒細胞的N1-N2分化。流式細胞儀結果顯示，CRC來源的外泌體可以增加N2中性粒細胞的百分比，這與N2標記CD11b+/Ly6G+/Ly6Clow的上調一致(圖6). 在circPACRGL敲低的細胞組中顯著降低，而這種抑制作用加入CRC來源的外泌體后消失。然而，miR-142-3p/miR-506-3p抑制劑處理或TGF-β1高表達可顯著加速N1-N2的分化在CRC來源的外泌體處理的circPACRGL敲低細胞中。總的來說，我們發現CRC來源的外泌體circPACRGL通過miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1軸調控N1-N2中性粒細胞的分化。

總結：

1. 文章中發現了腫瘤來源外泌體中circPACRGL。

2. 研究發現了circPACRGL通過miR-142-3p/miR-506-3p-TGF- 271增強CRC細胞的增殖、遷移和侵襲，以及N1-N2中性粒細胞的分化。

3. 研究發現了circPACRGL在CRC細胞存活和轉移中起著致癌作用。

4. 文章為研究circRNA在CRC中的作用提供了理論依據。