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LINC00941促進(jìn)大腸癌轉(zhuǎn)移

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2020-10-23
LINC00941是一種新的lncRNA,在腫瘤發(fā)生過程中表現(xiàn)出原發(fā)性和促轉(zhuǎn)移行為。然而,其在轉(zhuǎn)移性大腸癌中的作用仍不清楚...

    LINC00941是一種新的lncRNA,在腫瘤發(fā)生過程中表現(xiàn)出原發(fā)性和促轉(zhuǎn)移行為。然而,其在轉(zhuǎn)移性大腸癌中的作用仍不清楚。因此,小編給大家介紹發(fā)表于影響因子為10.717的“Cell Death & Differentiation”的文章“LINC00941 promotes CRC metastasis through preventing SMAD4 protein degradation and activating the TGF-β/SMAD2/3 signaling pathway”,旨在探討LINC00941在大腸癌轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制。

    在本文中,大腸癌中LINC00941表達(dá)上調(diào),且上調(diào)LINC00941與預(yù)后不良有關(guān)。在功能上,LINC00941促進(jìn)裸鼠的遷移和侵襲能力,加速肺轉(zhuǎn)移。在機(jī)制上,LINC00941激活了大腸癌細(xì)胞中的EMTLINC00941通過直接結(jié)合SMAD4蛋白MH2結(jié)構(gòu)域并與β-TrCP競(jìng)爭(zhēng)以阻止SMAD4蛋白降解激活TGF-β/SMAD2/3信號(hào)通路,從而激活EMT。
技術(shù)路線:

結(jié)果:
1.LINC00941表達(dá)上調(diào)與大腸癌預(yù)后不良有關(guān)
    組織微陣列證實(shí)LINC00941在大腸癌組織中的擴(kuò)增表達(dá),LINC00941主要定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1a),在大腸癌組織中表達(dá)上調(diào)(圖1b)。Kaplan-Meier生存率和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析表明,與低LINC00941表達(dá)水平的CRC患者相比,具有較高LINC00941表達(dá)水平的CRC患者的總生存時(shí)間(OS)顯著縮短,表明較高的LINC00941水平是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(圖1c)。利用TCGA,我們發(fā)現(xiàn)LINC00941是一種轉(zhuǎn)移和生存相關(guān)的lncRNA,與癌旁非腫瘤組織相比(圖1d)在大腸癌組織中上調(diào),并且與大腸癌患者的OS時(shí)間相關(guān)(圖1e)。ISH染色進(jìn)一步證實(shí),LINC00941在腫瘤組織中的表達(dá)顯著增高,在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)最高(圖1f,g)。我們還比較了LINC00941在大腸癌細(xì)胞系(HT-29、HCT-116、SW480、SW620和LoVo細(xì)胞)和永生化正常結(jié)腸上皮細(xì)胞(FHC細(xì)胞)中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)LINC00941在所有研究的大腸癌細(xì)胞系中高表達(dá),尤其是在高侵襲性大腸癌細(xì)胞系(SW620和LoVo)中與FHC細(xì)胞相比過表達(dá),提示LINC00941在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著致癌作用(圖1h)。

2.LINC00941促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力,并激活EMT
    為了闡明LINC00941在大腸癌中的生物學(xué)意義,我們分別用攜帶LINC00941 cDNA或sh-LINC00941的慢病毒載體在HCT-116和LoVo細(xì)胞中過表達(dá)或沉默LINC00941。與對(duì)照組相比,HCT-116細(xì)胞中LINC00941的過表達(dá)顯著增加了細(xì)胞的侵襲和遷移能力,而LoVo細(xì)胞中LINC00941的下調(diào)對(duì)細(xì)胞的侵襲和遷移能力有相反的影響(圖2a,b)。用sh-LINC00941轉(zhuǎn)染的LoVo細(xì)胞處理的裸鼠產(chǎn)生的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)較少,而用LINC00941過表達(dá)的HCT-116細(xì)胞處理的裸鼠比相應(yīng)的對(duì)照組產(chǎn)生更多的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)(圖2c,d)。此外,與對(duì)照組相比,接受HCT-116-LINC00941細(xì)胞的裸鼠的OS較短,而接受LoVo-ShLINC00941細(xì)胞的裸鼠OS更長(zhǎng)(圖2e)。這些數(shù)據(jù)表明LINC00941對(duì)CRC進(jìn)展有促進(jìn)作用。此外,LoVo Sh-LINC00941細(xì)胞表達(dá)下調(diào),呈現(xiàn)出更多的上皮形態(tài),而HCT-116-LINC00941細(xì)胞與相應(yīng)對(duì)照組相比呈現(xiàn)出更多的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)(圖2f,g),這表明LINC00941可能通過激活EMT促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。HCT-116-LINC00941顯示ZO-1和E-cadherin的mRNA和蛋白質(zhì)水平降低,但波形蛋白、纖維連接蛋白和Twist1的mRNA和蛋白質(zhì)水平增加(圖2h,i)。相反,LoVo Sh-LINC00941細(xì)胞顯示ZO-1和Ecadherin的mRNA和蛋白質(zhì)水平增加,但波形蛋白、纖維連接蛋白和Twist1的mRNA和蛋白質(zhì)水平降低(圖2h,i),進(jìn)一步證實(shí)LINC00941至少部分通過調(diào)節(jié)EMT促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

3.LINC00941通過抑制SMAD4泛素化增強(qiáng)其穩(wěn)定性
    LncRNAs通常通過RNA-蛋白相互作用影響基因表達(dá)。因此,我們進(jìn)一步研究了可能與LINC00941相互作用的蛋白,以獲得關(guān)于LINC00941誘導(dǎo)的EMT在CRC轉(zhuǎn)移中的深入機(jī)制觀點(diǎn)。RNA下拉分析表明SMAD4可以特異性結(jié)合LINC00941(圖3a)。同時(shí),SMAD4在LoVo Sh-LINC00941細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),在HCT-116-LINC00941細(xì)胞中上調(diào)(圖3b)。一致地,SMAD4富集于生物素標(biāo)記的LINC00941組中(圖3c)。此外,通過瓊脂糖凝膠電泳和RIP分析進(jìn)一步驗(yàn)證了LINC00941和SMAD4之間的相互作用(圖3d,e)。為了確定LINC00941和SMAD4的確切結(jié)合區(qū)域,我們構(gòu)造了一系列截?cái)嗟腖INC00941和SMAD4結(jié)構(gòu)。LINC00941的1465到1895核苷酸可以結(jié)合SMAD4,而SMAD4的MH2結(jié)構(gòu)域和全長(zhǎng)SMAD4可以結(jié)合LINC00941(圖3f,g),表明LINC00941是SMAD4的結(jié)合伙伴。細(xì)胞質(zhì)lncRNAs通常負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)修飾的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。LINC00941抑制導(dǎo)致SMAD4蛋白表達(dá)減少,而LINC00941過表達(dá)上調(diào)SMAD4(圖3b)。此外,如LINC00941通過延長(zhǎng)其降解半衰期來(lái)增強(qiáng)SMAD4蛋白的穩(wěn)定性(圖3h,i),這意味著LINC00941可以通過其蛋白質(zhì)降解來(lái)調(diào)節(jié)SMAD4。由于SMAD4蛋白降解是通過泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)的,為了深入了解LINC00941誘導(dǎo)SMAD4降解的機(jī)制,我們用蛋白酶體抑制劑(MG132)處理LoVo-Sh-LINC00941細(xì)胞。通過Western blot分析確定,MG132顯著恢復(fù)了LoVo-Sh-LINC00941細(xì)胞中的SMAD4蛋白水平(圖3j),表明泛素蛋白酶體途徑參與了LINC00941誘導(dǎo)的SMAD4降解。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn),我們?cè)u(píng)估了LINC00941過表達(dá)和LINC00941沉默的CRC細(xì)胞中SMAD4的多泛素化。如預(yù)期,當(dāng)LINC00941過表達(dá)時(shí),SMAD4泛素化顯著降低,而當(dāng)LINC00941被沉默時(shí),SMAD4泛素化顯著增加(圖3k,l)。綜上所述,這些數(shù)據(jù)表明LINC00941可以通過抑制SMAD4在CRC中的泛素化而穩(wěn)定SMAD4。

4.LINC00941通過與β-TrCP競(jìng)爭(zhēng)抑制SMAD4泛素化
    鑒于SMAD4可被β-TrCP多泛素化和降解,我們?cè)u(píng)估了β-TrCP在大腸癌SMAD4泛素化和降解中的功能意義。在LoVo和HCT-116細(xì)胞中抑制β-TrCP的表達(dá)可以顯著提高SMAD4蛋白的表達(dá)水平(圖4a)。同樣,在抑制了LoVo和HCT-116細(xì)胞中β-TrCP的表達(dá)后,通過免疫沉淀發(fā)現(xiàn)SMAD4蛋白泛素化水平顯著降低(圖4b)。接下來(lái),我們發(fā)現(xiàn)缺少LINC00941顯著增加了SMAD4和β-TrCP的結(jié)合(圖4c)。相反,過表達(dá)LINC00941可以顯著提高抑制SMAD4和β-TrCP的結(jié)合(圖4d)。此外,我們進(jìn)一步確定SMAD4和FL-SMAD4的MH2結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合β-TrCP(圖4e),表明β-TrCP通過結(jié)合SMAD4和FL-SMAD4的MH2結(jié)構(gòu)域來(lái)控制SMAD4的泛素化和降解??紤]到SMAD4和FL-SMAD4的MH2結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合LINC00941,我們假設(shè)LINC00941通過與β-TrCP競(jìng)爭(zhēng)來(lái)抑制SMAD4泛素化。正如預(yù)期的那樣,競(jìng)爭(zhēng)性RNA下拉分析進(jìn)一步證實(shí)了LINC00941和β-TrCP之間的競(jìng)爭(zhēng)(圖4e)??傊?,這些數(shù)據(jù)證實(shí)了LINC00941可以通過與β-TrCP競(jìng)爭(zhēng)來(lái)提高SMAD4蛋白的穩(wěn)定性,從而防止SMAD4降解。

5.在轉(zhuǎn)移性大腸癌中,TGF-β1上調(diào)LINC00941,并與SMAD2/3信號(hào)通路的激活有關(guān)
    TGF-β1/SMAD信號(hào)通路是EMT的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,SMAD4是一個(gè)重要的輔因子。鑒于LINC00941對(duì)SMAD4的穩(wěn)定性很重要,并且LINC00941包含預(yù)測(cè)的TGF-β1靶點(diǎn),我們?cè)u(píng)估了LINC00941在TGF-β1/SMAD信號(hào)通路中的作用。結(jié)果表明,當(dāng)用TGF-β1處理LINC00941沉默的細(xì)胞時(shí),LINC00941水平顯著升高,而當(dāng)LINC00941過表達(dá)的細(xì)胞受到TGF-β1抑制劑disitertide的作用時(shí),內(nèi)源性LINC00941水平顯著降低(圖5a,b)。一致地,與對(duì)照組相比,TGF-β1處理增加了LINC00941沉默的細(xì)胞的侵襲和遷移能力,而TGF-β1受體的抑制減輕了LINC00941過表達(dá)細(xì)胞的侵襲和遷移能力(圖5c,d)。此外,與對(duì)照組相比,用disitertide處理過表達(dá)的LINC00941細(xì)胞顯示ZO-1和Ecadherin的mRNA和蛋白質(zhì)水平增加(圖5e,f)。相比之下,LINC00941沉默的細(xì)胞顯示ZO-1和E-cadherin的mRNA和蛋白質(zhì)水平降低,但波形蛋白、纖維連接蛋白和Twist1的mRNA和蛋白質(zhì)水平增加(圖5e,f),進(jìn)一步證實(shí)TGF-β1參與了LINC00941誘導(dǎo)的EMT。更重要的是,熒光素酶報(bào)告分析顯示,熒光素酶活性在使用TGF-β1處理后顯著增加(圖5g)。用LoVo Sh-LINC00941細(xì)胞和TGF-β處理的裸鼠產(chǎn)生更多的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié),而HCT-116-LINC00941細(xì)胞和disitertide處理的裸鼠比相應(yīng)的對(duì)照組產(chǎn)生更少的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)(圖5h,i)。此外,與對(duì)照組相比,用LoVo Sh-LINC00941細(xì)胞和TGF-β處理的裸鼠的OS較短,HCT-116-LINC00941細(xì)胞和disitertide處理的裸鼠的OS較對(duì)照組長(zhǎng)(圖5j)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了TGF-β1與LINC00941有很強(qiáng)的相互作用。

結(jié)論:
    我們的研究證實(shí),LINC00941通過阻止SMAD4蛋白降解激活TGF-β/SMAD2/3信號(hào)通路促進(jìn)大腸癌的轉(zhuǎn)移,為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)移性大腸癌的機(jī)制和新的潛在治療靶點(diǎn)提供了新的視角。