我們先前報道了Bmi-1與Raf激酶抑制蛋白（RKIP）之間的反向關系，這與胃癌（GC）的預后有關。今天小編為大家帶來發表于“molecular cancer”上的文章“Bmi-1-induced miR-27a and miR-155 promote tumor metastasis and chemoresistance by targeting RKIP in gastric cancer”，向大家介紹Bmi-1調控胃癌發展的機制。

    在本研究中，我們首先進行微陣列分析以確定在Bmi-1過表達的細胞中差異表達的miRNA譜。然后，鑒定出能夠調控RKIP的miRNA，通過qRT-PCR和Western blot檢測Bmi-1、miR-155、miR-27a和RKIP的表達，并通過熒光素酶報告實驗、qRT-PCR和Western blot證實了RKIP是miR-27a和miR-155的靶點。最后，我們研究了Bmi-1/miR-27a/RKIP和Bmi-1/miR-155/RKIP軸對腫瘤生長、增殖、遷移、侵襲、集落形成能力、轉移和耐藥的影響。
結果：
1.候選miRNA可能受Bmi-1表達的影響
    為了確定miRNAs是否參與了Bmi-1抑制RKIP，我們比較了Bmi-1異位表達（GES-1-Bmi-1）的細胞和對照細胞（GES-1）的miRNA表達譜。微陣列分析表明GES-1-Bmi-1細胞（圖1a）中有51個上調和72個下調的miRNAs，包括miR-27a、miR-155和miR-516。在所有差異上調的miRNAs中，miR-27a、miR-761、miR-155、miR-4725、miR-4784、miR-4329、miR-4765和miR516b被預測為靶向RKIP（圖1b）。我們選擇miR-27a和miR-155，并通過qRT-PCR證實它們在GES-Bmi-1細胞中上調（圖1c）。當Bmi-1基因在BGC823和SGC7901 GC細胞系中被敲除時，miR-27a和miR-155被下調（圖1d）。
    接著，為了探討Bmi-1、miR-27a、miR-155和RKIP在GC中的臨床意義，我們首先用qRT-PCR分析了它們的RNA表達水平。結果顯示，在GC組織中Bmi-1、miR-27a和miR-155表達較高，而RKIP表達較低（圖1e）。此外，Bmi-1、miR-27a和miR-155高表達和RKIP低表達的患者在腸型GC中的3年總生存率較短。上述四項指標與彌散型胃癌的3年總生存率無顯著相關性（圖1f）。綜上所述，我們的結果顯示Bmi-1、miR-27a和miR-155在GC中升高，與GC預后不良有關，而RKIP在GC中的表達水平較低，與預后良好相關。

2.miR-27a和miR-155負調控RKIP的表達
    如圖2a和b所示，miR-27a和miR-155顯著降低含有RKIP 3'UTR質粒的熒光素酶活性。此外，RNA EMSAs證實miR-27a與其同源的RKIP靶序列直接相互作用，但miR155沒有觀察到這種相互作用。如圖2c所示，miR-27a及其同源的RKIP mRNA寡核苷酸可結合在一起形成穩定的miRNA/mRNA復合物。然而，miR-155在不同的遷移率下顯示出兩條帶，表明miR-155沒有與RKIP mRNA的寡核苷酸結合形成穩定的復合物（圖2d）。此外，miR-27a/RKIP mRNA復合物能夠與SGC7901細胞質提取物相互作用，形成新的復合物（圖2e）。為了探討miR-27a和miR-155在RKIP表達中的作用，在轉染miR-27a模擬物/抑制劑或miR-155模擬物/抑制劑后，對BGC823和SGC7901 GC細胞進行了Western blot分析和相應的密度分析。結果表明，miR-27a和miR-155模擬組的RKIP蛋白表達降低，而miR-27a和miR-155抑制劑組的表達增加與（圖2f）。然而，轉染miRNAs后RKIP的RNA表達沒有改變（圖2g）。

3.Bmi-1通過miR-27a和miR-155調控RKIP的表達
    為了證實Bmi-1對RKIP的調節作用是通過miR-27a和miR-155介導的，我們將miR-27a抑制劑和miR-155抑制劑引入GC細胞中。轉染Bmi-1后，BGC823和SGC7901細胞中RKIP的蛋白表達顯著降低，但miR-27a和miR-155抑制劑都能恢復RKIP的表達。與此相反，在轉染siBmi-1后，RKIP在BGC823和SGC7901細胞顯著增加，miR-27a模擬物和miR-155模擬物抑制了RKIP表達（圖3a）。此外，轉染miRNAs或siBmi-1后，RKIP的RNA表達沒有改變（圖3b）。總的來說，這些發現表明RKIP的表達受到Bmi-1通過miR-27a和miR-155的負調控。

4.在體外，Bmi-1通過miR-155和miR-27a調節細胞遷移、侵襲、增殖和化療敏感性
    我們通過Transwell法檢測BGC823和SGC7901細胞的遷移和侵襲行為。我們發現，與模擬對照組相比，Bmi-1基因敲除減少了遷移和侵襲細胞的數量，而miR27a或miR-155的共轉染增加了這些細胞的數量（圖4a）。MTS實驗表明miR-27a和miR-155的過表達導致細胞增殖的增加，而Bmi-1的下調抑制了細胞增殖，這可以通過miR-27a或miR-155的共轉染來抵消（圖4b）。菌落形成試驗表明，與陰性對照相比，Bmi-1被抑制時，菌落形成較少。然而，miR-27a或miR-155的共轉染逆轉了菌落形成能力的降低（圖4c）。接著，用MTS法檢測腫瘤細胞對化療的敏感性，當使用兩種常規化療藥物治療時，Bmi -1基因敲除細胞表現出比對照組細胞更少的化療耐藥性。此外，為了確定Bmi-1在藥物治療過程中是否通過miR-27a或miR-155在細胞凋亡中起重要作用，我們還將miR-27a模擬物和miR-155模擬物轉染到shBmi-1細胞中。我們發現miR-27a和miR-155顯著減弱Bmi-1沉默對藥物誘導的細胞凋亡的影響（圖4d）。因此，可以推斷Bmi-1通過miRNA依賴機制部分調節化療敏感性。

5.Bmi-1基因敲除通過miR-27a和miR-155抑制腫瘤生長、轉移和耐藥
    為了驗證Bmi-1和miR-27a/ miR-155在腫瘤生長、轉移定植和耐藥中的作用，將BGC823-NC模擬物、BGC823-miR-155模擬物、BGC823-miR-155模擬物、BGC823-miR-27a模擬物、BGC823-miR-27a模擬物、BGC823-shbc-1、BGC823-shBmi-1、BGC823-shcon+NC模擬物、BGC823shBmi-1+miR-155模擬物和BGC823-shBmi-1+miR27a模擬物細胞皮下或靜脈注射入裸鼠體內。注射shBmi-1的小鼠腫瘤生長明顯減弱，而注射miR-155模擬物或miR-27a模擬物的小鼠則顯示相反的效果，并且腫瘤生長增加（圖5a-c）。免疫組化結果也證實了這一點（圖5d）。正如預期的，我們觀察到BGC823 shBmi-1組比對照組有更少的肺和肝轉移。我們還注意到，BGC823 miR-27a模擬組和BGC823-miR-155模擬組在肺和肝臟的轉移灶數量都有顯著增加。此外，與BGC823shBmi-1+miR-155模擬細胞或BGC823shBmi-1+miR-27a模擬細胞相比，小鼠肺部和肝臟中的病灶數量顯著上調（圖6a-c）。
    為了評估腫瘤細胞的化療敏感性，我們建立了皮下異種移植，然后評估了它們對5-Fu治療的反應。治療14天后，處死小鼠，并腫瘤切除并稱重。結果表明，與對照組相比，miR-155模擬組和miR-27a模擬組的腫瘤明顯大于對照組，顯示出對5-Fu的耐受性（圖6d-f）。然而，與對照組相比，shBmi-1在抑制腫瘤生長和提高對5-Fu的敏感性方面表現出明顯更強的作用。值得注意的是，與shBmi-1+miR-155模擬物或shBmi-1+miR-27a模擬物共轉染組的腫瘤比shBmi-1組的腫瘤生長快得多，這表明miR-155模擬物和miR-27a模擬物能夠降低BGC823細胞對5-Fu的敏感性（圖6g-i）。總的來說，shBmi-1的作用可以通過miR-27a模擬物或miR-155模擬物的作用來降低RKIP的表達。

結論：
    綜上所述，本研究表明Bmi-1 通過miR-27a和miR-155對胃癌轉移抑制基因RKIP產生負調控作用。此外，由于Bmi-1/miR-27a/RKIP和Bmi-1/miR-155/RKIP信號軸在腫瘤轉移和耐藥中扮演重要角色，它們可能成為新的胃癌治療方法的有效靶點。