2020年5月，《Nat Commun》雜志發表“N-GSDMD trafficking to neutrophil organelles facilitates IL-1β release independently of plasma membrane pores and pyroptosis.”文章，此報道發現在人和小鼠中性粒細胞中卻發現了不一樣的結論，雖然在NLRP3炎性小體激活時仍然分泌IL-1β，但N-GSDMD并不會聚集到質膜（PM），也不增加PM的通透性或引起焦亡。通過一系列的生化實驗對質膜通透性的功能分析、亞細胞組分的生化分析，以及用一種識別N-GSDMD但不識別pro-GSDMD的新型單克隆抗體對單個中性粒細胞的超分辨成像，作者發現炎癥激活的中性粒細胞和巨噬細胞的巨大差異,在中性粒細胞在中存在：1.N-GSDMD不會聚集在質膜中成孔；2.不激活Ca2+調節的質膜修復；3.不將N-GSDMD蛋白轉運到質膜，而是將N-GSDMD轉運到嗜藍顆粒（azurophilic granules，易被苯胺藍染）和自噬體；4.通過自噬機制依賴的途徑釋放IL-1β。此外，N-GSDMD通透性釋放彈性蛋白酶到胞漿中，介導絲氨酸蛋白酶依賴的GSDMD二次斷裂。這些結果表明，N-GSDMD的動態分布除了與質膜結合外，還與豐富的細胞內細胞器膜結合，這些發現揭示了中性粒細胞和巨噬細胞之間GSDMD轉運的根本差異，這是炎癥激活過程中中性粒細胞特異功能的基礎。

機制圖：

結果：
一、中性粒細胞中沒有漿膜GSDMD孔

    目前還沒有研究直接檢驗N-GSDMD在黑質素或ATP激活NLRP3炎性小體后是否會在中性粒細胞質膜中形成氣孔。我們發現，正如報道的那樣，nigericin觸發了C57BL/6巨噬細胞中強勁的碘化丙啶(PI)內流，而不是Gsdmd?/?巨噬細胞 (Fig. 1a, b). 活化的巨噬細胞進行成像結果顯示甘氨酸抑制焦亡。然而，在沒有甘氨酸的情況下，nigericin可刺激C57BL/6巨噬細胞釋放LDH，而不刺激Gsdmd /巨噬細胞釋放(圖1c)。ATP觸發了類似的PI內流和LDH釋放反應，且是Gsdmd依賴的(補充圖2a c)。我們還觀察到，在nigericin刺激的人THP-1巨噬細胞中，PI被快速攝取，而在CRISPR產生的Gsdmd / THP-1細胞中則沒有(圖1d)。
    與巨噬細胞形成鮮明對比的是，C57BL/6小鼠在被黑質素或ATP刺激后，骨髓中性粒細胞中PI攝取和LDH釋放均未增加(圖1e g，補充圖2d f)。定量流式細胞術證實了巨噬細胞和中性粒細胞在PI攝取上的差異(補充圖2g-j)。同樣，健康受試者(n = 8)在黑質酸蛋白或ATP刺激下，經lps誘導的血液中性粒細胞中也未檢測到PI的攝取(圖1h, i)和LDH的釋放(補充圖3a)，盡管這些刺激導致IL-1β分泌旺盛(補充圖3b)。因此，在IL-1β釋放速率高的時間點，小鼠和人中性粒細胞在質膜上不會積累有功能的GSDMD孔。與Gsdmd - / -中性粒細胞相比，黑質酸處理的C57BL/6中性粒細胞的PI積累略有增加(圖1e)可能反映了骨髓中未成熟和成熟的中性粒細胞亞群之間的異質性，而在受刺激的人血中性粒細胞中沒有觀察到這種異質性(圖1h)。
    針對巨噬細胞漿膜中GSDMD孔的積累，激活強大的Ca2+影響依賴的膜修復機制，以對抗熱腐蝕裂解。我們比較了在無Ca2+或Ca2+補充的培養基中受到黑質酸刺激的小鼠中性粒細胞和巨噬細胞的PI內流和LDH釋放反應. 如圖1j、k所示，細胞外Ca2+的缺失(以及隨之而來的Ca2+內流)顯著增加了nlrp3活化的巨噬細胞中PI內流和LDH的釋放，這與IL-1釋放增強相關(補充圖4a)。相比之下，細胞外Ca2+的缺失并不促進或改變nlrp3激活的中性粒細胞的PI通透性、LDH釋放或IL-1抑制分泌(圖1l, m，補充圖4b)。
    GSDMD和GSDMA3膜孔的低溫電鏡結構顯示出與孔形成蛋白的MACPF/CDC(膜攻擊復合物穿孔蛋白樣/膽固醇依賴性溶胞素)家族成員類似的拓撲結構。因此，我們研究了中性粒細胞中GSDMD孔形成的缺失是否是由于其質膜對成孔蛋白作用的內在阻力。C57BL/6和Gsdmd?/?中性粒細胞被亞溶解濃度的肺炎鏈球菌外毒素溶肺素(Ply)刺激，后者是一種MACPF/CDC蛋白。Ply誘導嗜中性粒細胞和巨噬細胞大量PI內流，盡管與Gsdmd?/?巨噬細胞相比，C57BL/6巨噬細胞在對Ply的反應中表現出更大的PI內流(補充圖5a)。我們使用NLRP3抑制劑MCC950表明，這是由于通過Ply孔的一次內流和通過N-GSDMD孔的二次內流的共同作用造成的。
    因此，在中性粒細胞NLRP3炎性小體激活過程中，GSDMD不會在細胞膜上形成小孔，這不是Ca2+依賴的膜修復或對MACPF/ cdc樣孔形成蛋白的內在抵抗的結果。
二、N-GSDMD不定位于中性粒細胞質膜

    為了確定中性粒細胞中沒有質膜GSDMD孔的機制，我們通過western blot和免疫熒光成像檢查了GSDMD的處理和N-GSDMD的定位。中性粒細胞提取物常規在補充了Diisopropyl Fluorophosphate (DFP)的RIPA裂解緩沖液中制備，DFP是一種對中性粒細胞顆粒中高水平存在的多種絲氨酸蛋白酶的不可逆抑制劑。通過結合全細胞裂解液和細胞外上清進行western blot分析，我們發現NLRP3激活的小鼠中性粒細胞中p52 pro-GSDMD與p31 N-GSDMD的過程在定性上與小鼠巨噬細胞相似(圖2a)。但中性粒細胞中p31 N-GSDMD的積累量低于巨噬細胞。使用針對小鼠GSDMD的兩種不同抗體克隆，我們發現在NLRP3炎性小體激活之前，lps介導的中性粒細胞和巨噬細胞中p52前GSDMD水平相似(圖2a和補充圖6a);然而，與巨噬細胞相比，nlrp3激活的中性粒細胞中p31 N-GSDMD較少，這與cleaved caspase-1的產生減少有關(圖2a)。pan-caspase抑制劑zVAD阻斷了中性粒細胞p31 NGSDMD的Pro-GSDMD裂解(圖2b)，表明與巨噬細胞3,20一樣，中性粒細胞p31 N-GSDMD的積累依賴于caspase。
    受nigericin刺激的小鼠巨噬細胞除了產生p31 N-GSDMD外，還產生28 kDa的N-GSDMD產物(圖2a和補充圖6b)。較小的GSDMD產物的積累被DEVD-fmk抑制(Supplementary Fig. 6b)，表明在GSDMD裂解過程中除了caspase-1, caspase-3/7也起作用。這與caspase-1在炎性體刺激的巨噬細胞中二次激活caspase-7的報道一致21。雖然caspase-3/7可以在asps -8722位點切割人和小鼠的GSDMD，但在小鼠，而不是人，GSDMD也含有IPVD motif中的asps -27。caspase-1和caspase- 7聯合裂解ps -276位點的小鼠GSDMD，可以得到27.4 kDa的產物。
    我們還使用兩種不同的人GSDMD抗體，比較了GSDMD在人血中性粒細胞和人THP-1巨噬細胞中的表達和加工過程(圖2c)。H-6兔單克隆抗體(Santa Cruz)可識別proGSDMD和p31 N-GSDMD，而一種新的兔單克隆抗體(Abcam EPR20829-408)最初由Shao和同事產生，目前已上市，可識別人p31 N-GSDMD裂解產物，但不能識別pro-GSDMD。我們發現，H-6 Ab可以檢測到THP-1細胞和人中性粒細胞中的pro-GSDMD，而EPR20829-408不能檢測到(圖2c)， EPR20829-408在中性粒細胞和THP-1細胞中均檢測到p31-N-GSDMD。盡管H6 Ab檢測到黑質粒素刺激THP-1巨噬細胞45分鐘后proGSDMD處理接近完成，但ATPor黑質粒素刺激的人中性粒細胞中的p31-N-GSDMD低于H6檢測閾值。因此，人和鼠中性粒細胞一樣，在NLRP3炎癥小體信號傳導過程中積累p31 N-GSDMD，但其數量水平低于巨噬細胞。
    在LPS/nigericin活化的THP-1巨噬細胞中，n- gsdmd與質膜標記物小麥胚芽凝集素(WGA)共定位，而僅用LPS引物修飾的THP-1細胞缺乏抗n- gsdmd反應性(圖2d, e)。
在nlrp3刺激的Gsdmd / THP-1巨噬細胞中也沒有NGSDMD染色(補充圖7)。
    與THP-1巨噬細胞相比，通過Imagestream分析，N-GSDMD不在nlrp3激活的人中性粒細胞的質膜中檢測到，而是在細胞內基因座中積累(圖2f)。共聚焦顯微鏡顯示，中性粒細胞胞漿中有離散的N-GSDMD點狀染色，而巨噬細胞中N-GSDMD定位于細胞表面(圖2g)。
    因此，盡管p31 N-GSDMD在caspase-1活化的人中性粒細胞中產生，但它并不定位于質膜，因此也不形成有功能的細胞表面孔。相反，N-GSDMD作為指示細胞器的胞內斑點積累。
三、N-GSDMD介導中性粒細胞彈性蛋白酶的胞漿釋放

    我們使用生化和成像方法識別nlrp3激活的小鼠中性粒細胞和巨噬細胞中N-GSDMD的亞細胞定位。用N2空化產生無洗滌劑細胞勻漿，并連續離心，如圖3a所示:
    (a)除去細胞核和未分裂的細胞700 g， (b) 10k g產生P10亞細胞器餾分，(c) 100k g分離質膜(P100)和細胞質(S100)。每個部分的蛋白用SDS-PAGE分解，用western blot檢測GSDMD的pro和cleaved形式。與之前的分析一致(見3,20)，p31-N-GSDMD在LPS/ atp刺激的巨噬細胞的P100組分中積累，并在質膜標記物cadherin中富集(圖3b)，在P10組分中也富集。與巨噬細胞相比，p31-N-GSDMD在LPS/ atp活化的中性粒細胞P100組分中未檢測到，但與巨噬細胞相比，N-GSDMD在S100細胞質和P10顆粒組分中檢測到(圖3b)。在LPS/nigericin刺激的中性粒細胞和巨噬細胞制備的亞細胞組分中也觀察到類似的結果(補充圖8a)。被LPS引物而非炎性體激活的中性粒細胞在胞漿中僅顯示全長pro-GSDMD(補充圖8b)。在這些分離過程中，受刺激的中性粒細胞釋放成熟的IL-1和caspase-1 p20進入細胞外培養基，盡管細胞膜上沒有p31 N-GSDMD(補充圖8c)。此外，p31 N-GSDMD被釋放到受刺激巨噬細胞的培養上清中，但沒有中性粒細胞(Supplementary Fig. 8d)，與巨噬細胞的焦解一致，但沒有中性粒細胞。
    NLRP3激活的中性粒細胞和巨噬細胞的P10組分中存在p31 N-GSDMD，而非未受刺激的細胞，這與兩種細胞類型中多個胞內細胞器標記的存在相關;其中包括線粒體(Tom-20和ATBP1)和自噬體(LC3-II)(圖3c)。然而，P10部分的中性粒細胞，而不是巨噬細胞，在嗜氮顆粒標志物(髓過氧化物酶/ MPO和中性粒細胞彈性酶/NE)中富集。為了確定N-GSDMD是否為嗜氮顆粒，我們先用ATP刺激lps誘導的人血中性粒細胞45分鐘，然后用N-GSDMD選擇性EPR208209抗體和抗mpo進行免疫染色。通過成像掃描分析(圖3d)和超分辨率成像(圖3e, f)檢測細胞。通過Imagestream分析檢測代表性細胞，發現N-GSDMD和MPO點狀染色(圖3d);然而，這種關聯在超分辨率圖像中更為明顯，顯示在25 75%的N-GSDMD斑點中N-GSDMD與MPO (<50 nm)接近(圖3e, f)。我們在LPS/ATP刺激下分離C57BL/6和Gsdmd /小鼠的骨髓中性粒細胞，分離無器官的S100細胞質部分，并通過western blot檢測中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)。我們發現，NE在C57BL/6中性粒細胞的細胞質中隨時間積累，而在Gsdmd /中性粒細胞中不積累(圖3g)。
四、N-GSDMD在中性粒細胞中定位為LC3+自噬體

    我們比較NLRP3 inflammasome-mediated生產和釋放il - 1β分泌在初級中性粒細胞從控制鼠標應變表達ATG7液氧軌跡(Atg7f / f)與中性粒細胞從老鼠myeloid-specific刪除ATG7派生與LysMCre穿越后小鼠(Atg7MΔ)27。Nigericin——或者ATPstimulated il - 1β釋放顯著減少Atg7MΔ中性粒細胞相對于Atg7f / f中性粒細胞(圖4),水平的pro-IL-1β,proGSDMD p31-N-GSDMD發現Atg7f / f和Atg7MΔ中性粒細胞溶解產物(圖4 b)。
    ASC寡聚化和caspase-1處理也相同的刺激Atg7f / f和Atg7MΔ中性粒細胞(補充圖12)。因此，ATG7在IL-1釋放中的作用是在NLRP3炎癥小體組裝和caspase-1前IL-1的下調的下游。與中性粒細胞,沒有差別在il - 1β分泌Atg7f / f和Atg7MΔNLRP3刺激中巨噬細胞完整的氨基酸培養基后食道(圖4 c)。
    降低il - 1β的中性粒細胞釋放Atg7MΔ小鼠擬表型觀察到的響應從Gsdmd /小鼠中性粒細胞。在典型炎性小體激活后IL-1抑制分泌，細胞內保留p17 IL-1抑制物，而IL-1前總細胞積累或活性caspase-1的生成沒有差異(圖4d, e)。

    為了確定N-GSDMD是否與中性粒細胞自噬體相關，我們將LPS/ atp刺激的人中性粒細胞與N-GSDMD抗體和LC3共染色，用于單細胞成像和超分辨率顯微鏡觀察。我們通過Imagestream檢測N-GSDMD與LC3斑點的重疊(圖5a)，風暴成像顯示約25%的N-GSDMD斑點與LC3非常接近(50 nm)(圖5b, c)。
    3個代表性細胞LC3+/N-GSDMD+小泡的高亮區域與N-GSDMD整合到自噬體膜一致(圖5b，右面板)。

    為了進一步研究自噬是否在中性粒細胞分泌IL-1的過程中發揮作用，我們使用Hsp90抑制劑格爾達霉素抑制貨物裝載進入自噬機制。Schekman和他的同事在自噬輔助IL-1分泌的HEK293細胞工程模型中證明，格爾達那霉素阻斷了Hsp90伴侶輔助的成熟IL-1細胞轉運到自噬小體囊膜中間產物。
    在LPS啟動后，在nigericin或ATP激活NLRP3之前，12個供體外周血的人中性粒細胞和小鼠中性粒細胞被格爾達那霉素孵育。每個人供體的格爾達那霉素處理的中性粒細胞IL- 1分泌均受到顯著抑制(圖6a)，其抑制不是由于細胞活力受損，因為傳統的ER-Golgi途徑對CXCL8/IL-8的分泌沒有影響(圖6b)。
    與對照組相比，格爾達霉素處理的小鼠中性粒細胞釋放的IL-1蛋白也明顯減少，而CXCL2的分泌沒有受到抑制(圖6c, d)。
    此外，在nlrp3激活的小鼠中性粒細胞中，格爾達霉素處理沒有抑制ASC寡聚、caspase-1處理或GSDMD裂解(圖6e)，表明N-GSDMD作用于炎性小體組裝和caspase-1激活的下游，從而抑制IL-1的出口。