tRNA衍生的小RNA(TsRNAs)參與了許多細胞過程，但具體機制尚不清楚。以前發現Leu-CAG tRNA衍生的小RNA的3’端(LeuCAG3‘tsRNA)通過維持核糖體蛋白S28(RPS28)的水平來調節人類核糖體的生物發生。本文通過實驗進一步驗證了LeuCAG3的tsRNA可能通過一種保守的基因調控機制在脊椎動物中維持核糖體的生物發生，并于2019年12月發表在Cell Reports（IF：7.815）。

本文亮點：

1、在脊椎動物中LeuCAG3‘tsRNA的目標靶點位于保守的RPS28編碼區；
2、LeuCAG3‘tsRNA在人和小鼠中均可調節RPS28起始階段翻譯；
3、LeuCAG3‘tsRNA調控的翻譯在人和小鼠間保守
4、tsRNA調控的翻譯機制可能在脊椎動物中保守

主要結果：
1、脊椎動物中RPS28 mRNA上的靶位點區域保守
    作者先從44個脊椎動物的基因組tRNA數據庫中篩選得到22nt的LeuCAG3‘tsRNA。通過構建系統進化樹發現LeuCAG3‘tsRNA在RPS28 mRNA上的靶位點具有保守性（圖1A），還發現兩個潛在靶點，一個在CDS區，一個在3‘UTR（圖1B和C）。靶點A和靶點B的堿基組成和結構如圖D和E所示。

圖1位于RPS28的CDS區的LeuCAG3‘tsRNA目標靶點在哺乳動物和鳥類中保守進化，且小鼠的Rps28 mRNA具有雙鏈二級結構

2、在小鼠中LeuCAG3‘tsRNA對于18S rRNA的功能是必須的
    前人的研究顯示，在人類細胞中降低RPS28蛋白可通過抑制LeuCAG3‘tsRNA從而損害18S rRNA的處理途徑，同時可降低人類癌細胞的生活力。于此結果類似，在小鼠中抑制LeuCAG3‘tsRNA可顯著降低Hepa 1-6細胞的生活力（圖2A）。此外，實驗結果顯示抑制LeuCAG3‘tsRNA顯著降低了18S rRNA的水平，但并沒有顯著影響28S rRNA的豐度，并且LeuCAG3‘tsRNA不影響18S rRNA的翻譯而是處理34S媒介RNA的必須物質（圖2B-D）。

 圖2 在小鼠細胞中LeuCAG3‘tsRNA對于18S rRNA的功能是必須的

3、LeuCAG3‘tsRNA調控小鼠Rps28 mRNA翻譯
    抑制LeuCAG3‘tsRNA后使用WB和qPCR檢測了Rps28 的蛋白和mRNA水平，結果顯示Rps28 的蛋白水平顯著下降而mRNA水平不變，證明LeuCAG3‘tsRNA影響翻譯（圖3A-C）。之后作者對Rps28 mRNA進行分級，并對較重Rps28 mRNA向較輕Rps28 mRNA轉化的部分進行了計算量化，如圖3D所示，與對照相比，抑制LeuCAG3‘tsRNA后，向較輕Rps28 mRNA轉化的數量明顯增多。以上結果證實LeuCAG3‘tsRNA調控小鼠和人的Rps28 mRNA翻譯。
    進一步探究LeuCAG3‘tsRNA的作用靶點是A還是B，進行了WB實驗。如圖3E-F所示，與野生型相比，抑制靶點A時Rps28 蛋白水平顯著升高，而抑制靶點B后Rps28 蛋白的水平無顯著變化，表明靶點B在細胞中并不活躍。
    總之，以上結果表明小鼠LeuCAG3‘tsRNA調控Rps28 蛋白翻譯主要依賴于CDS區域的保守靶點A而非靶點B。

圖3在小鼠中LeuCAG3‘tsRNA通過堿基互補與CDS靶位點配對對于Rps28 mRNA的翻譯是必須的

4、LeuCAG3‘tsRNA在人和小鼠中調控Rps28 mRNA翻譯后的起始階段
    作者模擬了使用哈林通堿或NaAsO2受LeuCAG3‘tsRNA影響翻譯的示意圖（圖4A）。如果tsRNA影響80S復合物的形成，則哈林通堿或NaAsO2處理會使RPS28 mRNA停滯在40S亞基附近；如果tsRNA影響80S復合物形成后的步驟，則哈林通堿或NaAsO2處理會使RPS28 mRNA停滯在80S復合物上。
    實驗結果如圖4B所示，與預期一致，哈林通堿或NaAsO2處理后RPS28 mRNA通常在9和14位點發生遷移，并累積在80S單核糖體上。此外，哈林通堿或NaAsO2處理后的細胞中抑制LeuCAG3‘tsRNA并不影響RPS28 mRNA在80S單核復合體上的積累。以上結果表明LeuCAG30tsRNA在人和小鼠中的翻譯后起始水平上調節RPS28 mRNA。

圖4 在人和小鼠中LeuCAG3‘tsRNA調控RPS28延伸階段的翻譯

    本文報道了在靈長類動物中存在功能性的3‘UTR靶位點，而在許多脊椎動物中存在CDS靶位點。作者證實，這個tsRNA也通過與CDS目標位點相互作用來調節小鼠Rps28的翻譯。進一步證實，mRNA翻譯的變化發生在兩個物種的啟動后步驟。總體而言，結果表明LeuCAG3的tsRNA可能通過一種保守的基因調控機制在脊椎動物中維持核糖體的生物發生。

參考文獻：
Kim Hak Kyun., Xu Jianpeng., Chu Kirk., Park Hyesuk., Jang Hagoon., Li Pan., Valdmanis Paul N., Zhang Qiangfeng Cliff., Kay Mark A. (2019). A tRNA-Derived Small RNA Regulates Ribosomal Protein S28 Protein Levels after Translation Initiation in Humans and Mice. Cell Rep, 29(12), 3816-3824.e4. doi: 10.1016/j.celrep.2019.11.062。