自然殺傷（NK）細胞在先天性抗腫瘤免疫反應中起關鍵作用。最近，已經在包括肝細胞癌（HCC）在內的各種惡性腫瘤中證實了NK細胞功能障礙。然而，人類肝癌中NK細胞功能障礙的分子生物學機制仍然不清楚。6月27日，來自復旦大學中山醫院肝癌研究所的張鵬飛團隊在molecular cancer（IF=15.302）上發表論文。他們報道在人類HCC組織中circUHRF1的表達高于在匹配的相鄰非腫瘤組織中的表達。 circUHRF1水平升高表明HCC患者的臨床預后較差，NK細胞功能異常。在HCC患者血漿中，circUHRF1主要通過外泌體方式由HCC細胞分泌，而circUHRF1抑制NK細胞衍生的IFN-γ和TNF-α的分泌。血漿外泌體circUHRF1的高水平與NK細胞比例減少和NK細胞腫瘤浸潤減少有關。此外，circUHRF1通過miR-449c-5p的降解上調TIM-3的表達來抑制NK細胞的功能。最后，他們表明circUHRF1可能會導致HCC患者抗PD1免疫療法產生抗藥性。以上結果為HCC患者提供潛在的治療策略。
技術路線：

結 果：
1.肝癌組織中與UHRF1相關的circRNA的分析
        UHRF1經常被上調，并且在HCC的進展中起著關鍵的病理作用。因此，通過qRT-PCR檢查了從UHRF1衍生的14個circRNA的水平。其中，hsa_circ_0048677（circUHRF1）是最豐富的circRNA，在HCC組織中被上調（圖1a和b）。然后，通過qRT-PCR檢查了circUHRF1在240例HCC組織和匹配的鄰近非腫瘤組織中的表達。 HCC組織中CircUHRF1的表達明顯高于相鄰的非腫瘤組織（腫瘤/相鄰的非腫瘤組織≥2； 136/240）（圖1c和d）。接下來探究circUHRF1表達與240例HCC患者的臨床病理特征之間的關系。結果表明，circUHRF1表達與臨床病理特征顯著相關（圖1e-g）。Kaplan-Meier生存分析表明，circUHRF1高表達水平的患者的臨床預后較差（圖1h和i）。綜上所述，HCC細胞中circUHRF1表達上調與患者不良預后相關，并表明circUHRF1表達增加可能與HCC的進展有關。

2.HCC細胞以外泌體方式分泌circUHRF1
        假設circUHRF1可以通過外泌體從HCC細胞轉移到其他細胞。為了驗證這一假設，從HCC細胞系上清液中分離了外泌體，并通過TEM和Western印跡進行了評估（圖2a和b）。在六個HCC細胞系和成對的外泌體中進行qRT-PCR分析，結果與其他細胞系相比，HCCLM3和SMMC-7721細胞系中circUHRF1明顯上調，外泌體表達結果與親代細胞的表達水平一致（圖2c和2d）。與20名健康捐獻者相比，HCC患者血漿外泌體circUHRF1水平升高（圖2e）。此外，腫瘤切除后血漿外泌體circUHRF1水平降低，而在腫瘤復發患者中血漿外泌體circUHRF1水平升高，表明血漿外泌體circUHRF1主要由HCC細胞產生（圖2e）。有免疫逃逸的患者血漿中外泌體circUHRF1水平顯著升高，外周血中NK細胞比例降低（圖2f）。這些數據表明血漿外泌體circUHRF1可以作為NK細胞相關的免疫逃逸的關鍵分子。

3.HCC細胞通過外泌體circUHRF1抑制NK細胞功能
        為了確定HCC衍生的外泌體circUHRF1是否能誘導異體NK細胞發生改變，將來自6個健康供體的NK細胞與HCCLM3和SMMC-7721細胞以1：1的比例共培養24小時（圖3a）。與SMMC-7721和HCCLM3細胞共培養的NK細胞表現出IFN-γ和TNF-α分泌的顯著損害，circUHRF1表達顯著增加（圖3a-d），這被外泌體抑制劑GW4869削弱（圖3e）。NK細胞與SMMC-7721和HCCLM3細胞先共培養，再用外泌體抑制劑處理，IFN-γ和TNF-α的分泌減弱（圖3f和g）。為了進一步研究是否以外泌體circUHRF1依賴性方式介導HCC細胞對NK細胞功能的抑制作用，使用SMMC-7721和shRNA慢病毒載體建立了circUHRF1表達下調細胞。結果表明，外泌體circUHRF1水平的降低可有效減弱NK細胞中HCC衍生的外體誘導的IFN-γ和TNF-α分泌的損傷（圖3h-j）。這些結果共同表明，源自HCC的外泌體circUHRF1能損害NK細胞的功能。

4.CircUHRF1和miR-449c-5p在NK細胞中彼此降解
        通過StarBase v3.0分析，預測有14個miRNAs可能是circUHRF1的靶標。使用circUHRF1特異性探針進行circRNA體內沉淀（circRIP），并使用qRT-PCR檢測了與circUHRF1形成復合體的14種預測miRNA。結果表明，與陰性對照相比，circUHRF1和miR-449c-5p顯著富集（圖4a），表明miR-449c-5p是與circUHRF1相互作用的miRNA。接下來進行一系列實驗來驗證這一結果（圖4b-e）。此外，在NK-92細胞中過表達miR-449c-5p后circUHRF1的水平顯著降低，而在circUHRF1過表達后miR-449c-5p的水平顯著降低（圖4f和g）。這些發現表明，circUHRF1和miR-449c-5p可能相互靶向，在NK細胞中相互影響。

5.CircUHRF1通過抑制miR-449c-5p活性上調TIM-3表達
        推測circUHRF1可能充當miR-449c-5p海綿通過上調miR-449c-5p靶標的表達水平增強HCC患者的免疫逃逸。為了驗證這一假設，首先分析了包括TIM-3在內的NK細胞中一組預測的miR-449c-5p靶基因（圖5a）。接下來進行了實驗驗證TIM-3是miR-449c-5p的靶基因（圖5b-d）。鑒于TIM-3相關途徑在免疫逃逸中的關鍵作用，假設circUHRF1可能通過其競爭性circRNA活性成為HCC免疫逃逸的重要助力者。為了進一步驗證這一假設，在單獨或與circUHRF1一起轉染miR-449c-5p模擬物的NK-92細胞中檢測到TIM-3表達。結果表明， miR-449c-5p強迫表達導致TIM-3的mRNA和蛋白表達水平降低，而circUHRF1逆轉了miR-449c-5p對TIM-3表達的這種抑制作用（圖5b和c）。為了進一步證實體外研究結果，調查了另一40例HCC患者中circUHRF1和miR-449c-5p / TIM-3表達之間的相關性外周NK細胞。發現circUHRF1表達與外周NK細胞中的miR-449c-5p表達負相關，circUHRF1表達與周圍NK細胞中TIM-3 mRNA表達正相關，miR-449c-5p表達與外周NK細胞中TIM-3 mRNA的表達負相關（圖5e-g），表明外泌體circUHRF1的上調消除了miR-449c-5p對NK細胞中TIM-3的抑制作用。

6.CircUHRF1以NK細胞依賴性方式誘導HCC進展
        為了進一步探索circUHRF1在肝癌中的功能，使用了pLO5-ciR-circUHRF1慢病毒載體來上調circUHRF1在PLC / PRF / 5細胞中的表達。 qRT-PCR結果顯示，轉染pLO5-ciRcircUHRF1的PLC / PRF / 5細胞的circUHRF1水平顯著高于轉染pLO5-ciR-Mock的細胞中的circUHRF1并且外泌體更高的circUHRF1水平（圖6a和6b）。使用PLC / PRF / 5細胞生成了NOD / SCID小鼠肺腫瘤轉移模型。結果表明，與轉染pLO5-ciR-Mock的HCC細胞相比，轉染pLO5-ciR-circUHRF1的PLC / PRF / 5細胞顯示出circUHRF1水平升高，誘導的轉移性腫瘤結節數目明顯增加，NKG2D陽性細胞數量明顯減少（圖6c-e）。這些結果表明circUHRF1以外泌體和NK細胞依賴性方式促進HCC進展。

7.CircUHRF1增強了肝癌抗pd1治療的耐藥性
        由于強制circUHRF1表達抑制了HCC中的NK細胞功能，因此評估了circUHRF1過表達是否可以進一步阻止抗PD1治療（Opdivo）的抗腫瘤作用。分析了30例接受抗PD1免疫治療的復發性遠處轉移（包括肺轉移）的HCC患者的回顧性數據。根據RECIST1.1分析，結果顯示，部分緩解（PR）3例，疾病穩定（SD）7例，進行性疾病（PD）20例，PD組的circUHRF1表達水平遠高于SD和PR組（圖7a）。為了進一步探討circUHRF1與免疫逃避之間的關系，檢查了30例HCC患者組織中NKG2D的表達。與對PD1敏感的HCC患者相比，對PD1耐藥的HCC患者的NKG2D陽性細胞數量明顯減少（圖7b）。分析顯示，HCC組織中circUHRF1表達與NKG2陽性細胞數之間呈負相關（R2 = 0.1452； P = 0.0377）（圖7c）。為了進一步評估circUHRF1對抗PD1治療的抗性，通過皮下植入circUHRF1基因下調的HCCLM3細胞或相應的陰性對照細胞建立了異種移植模型。結果表明，植入circUHRF1基因敲低的細胞可提高對抗PD1治療的敏感性，并提高總生存率（圖7d-f）。綜上所述，這些發現表明circUHRF1過表達可能會阻礙HCC對抗PD1治療的反應，而靶向circUHRF1可能是恢復HCC對抗PD1治療敏感性的有前途和有效的方法。

參考文獻：
        Zhang Peng-Fei., Gao Chao., Huang Xiao-Yong., Lu Jia-Cheng., Guo Xiao-Jun., Shi Guo-Ming., Cai Jia-Bin., Ke Ai-Wu.(2020). Cancer cell-derived exosomal circUHRF1 induces natural killer cell exhaustion and may cause resistance to anti-PD1 therapy in hepatocellular carcinoma. Mol. Cancer, 19(1), 110. doi:10.1186/s12943-020-01222-5