腎細胞癌（RCC）是泌尿外科中導致患者死亡的第二大腫瘤，僅在2018年就有約403426個新增病例。但是其治療始終沒有非常樂觀的進展。circRNA在許多疾病中被證實具有調控作用，并可作為治療靶標，但是在RCC中的作用尚不清楚。本文旨在探究RCC中是否存在某個關鍵circRNA參與調控了RCC的惡性進展，并于今年6月5日新近發表在《Molecular Cancer》（IF:10.679）期刊上。
結 果：
1、CircTLK1在RCC組織中過表達并于其不良預后有關
    通過腎上皮細胞和RCC細胞測序獲得差異表達序列，Fig. 1a是最顯著差異的10個circRNA。CircTLK1不僅在RCC細胞系和RCC組織中高表達，在術后轉移中RCC病人中也高表達，并預示著不良預后（Fig. 1b-f）。CircTLK1長247nt，包含兩個外顯子，不可被RNase R消化（Fig. 1g-i）。

圖1 CircTLK1在RCC組織中過表達并于其不良預后有關

2、敲除circTLK1抑制RCC細胞增殖
    shRNA-2可顯著抑制三種細胞系中circTLK1的表達，但對TLK1的表達沒有影響（Fig.a-c）。此外，使用shRNA-2干擾掉circTLK1的表達后RCC細胞的增殖能力顯著下降。

圖2敲除circTLK1抑制RCC細胞增殖

3、敲除circTLK1抑制RCC細胞遷移和侵襲

    如圖3a-c所示，shRNA-2干擾circTLK1的表達后RCC細胞的遷移和侵襲能力顯著下降。鑒于這種影響，作者進一步檢測了上皮間質轉化相關分子的表達，結果表明在circTLK1沉默的細胞中，間質標記物N-cadherin和vimentin表達明顯下降，而上皮標記物E-cadherin表達在circTLK1抑制的細胞中升高（圖3e）。

圖3敲除circTLK1抑制RCC細胞遷移和侵襲

4、circTLK1作為miR-136-5p海綿

    為分析circTLK1的分子途徑，使用FISH和核質分離實驗來檢測circTL1K的亞細胞定位，結果顯示主要分布在細胞質（Fig.4a-b），這暗示著circTLK1可能通過捕獲miRNA釋放其靶基因轉錄本發揮功能。在線預測獲得5個可與circTL1K結合的miRNA，然后生物素circTL1K探針在RCC細胞中顯著下拉circTLK1，而miR-136-5p是惟一被生物素circTL1K探針下拉的miRNA（Fig.4c-d）。之后熒光素酶實驗進一步證實兩者間的作用關系（Fig.4e-f）。然而，過表達或敲除circTL1K對RCC細胞中miR-136-5p的表達沒有影響（Fig.4i-j）。這些表明circTLK1對miR-136-5p起海綿吸附作用。

圖4 circTLK1作為miR-136-5p海綿

5、miR-136-5p通過靶向CBX4促進RCC進展

    在線預測miR-136-5p的靶基因有CBX4，GNAS，LUZP6，MSL2，MTMR4和SOCS7（Fig 5a），并進一步通過綜合轉錄分析發現miR-136-5p與CBX4的表達呈現負相關（Fig 5b）。熒光素酶實驗顯示共轉染miR-136-5p與野生型CBX4質粒后熒光素酶活性顯著升高，而轉染突變型CBX4則沒有變化（Fig 5c-d）。過表達miR-136-5p抑制了CBX4的mRNA和蛋白質水平（Fig 5e-g）。這些表明miR-136-5p直接靶向CBX4。此外，CBX4在RCC組織中上調表達，且與腫瘤大小和術后轉移呈正相關（Fig 5i-j）。RCC病人中高表達CBX4具有較低的總體生存率（Fig 5k）。

圖5 CBX4是miR-136-5p的直接靶點

6、CBX4敲除抑制細胞增殖，遷移和侵襲

    如圖6所示，使用shRNA干擾CBX4表達后，ACHN 和769-P細胞系的增殖，集落形成，遷移和侵襲能力都顯著下降。此外，CBX4的表達與VEGFA的表達呈正相關，shRNA干擾CBX4表達后VEGFA的表達顯著抑制。

圖6 CBX4敲除抑制細胞增殖，遷移和侵襲

7、過表達CBX4逆轉了circTLK1對細胞增殖和轉移的抑制作用

    為了探究circTLK1是否通過調控CBX4的表達改變腫瘤細胞的生物學功能，作者做了一個circTLK1和CBX4的拯救實驗。如圖7所示，敲除circTLK1明顯抑制了CBX4的mRNA和蛋白質水平。CBX4過表達顯著扭轉了circTLK1誘導的腫瘤細胞的增殖抑制作用。在細胞的遷移，侵襲，集落形成實驗中得出了一致的結果。上述表明circTLK1是通過調控CBX4的表達改變腫瘤細胞的生物學功能。

圖7過表達CBX4逆轉了circTLK1對細胞增殖和轉移的抑制作用

8、circTLK1敲低可抑制體內RCC細胞的生長和轉移

    為了探究在體內circTLK1對RCC腫瘤生長和肺轉移的作用，構建了穩定的轉染了shcircTLK1的769-P細胞并注射到裸鼠中從而構建裸鼠腫瘤移植及肺轉移模型。在腫瘤異種移植模型中，與shNC相比，shcircTLK1的小鼠腫瘤明顯更小，腫瘤的體積和和腫瘤也都顯著下降（Fig. 8a-c）。此外，shcircTLK1小鼠體內的Ki67，CBX4和VEGFA的表達水平顯著下降（Fig. 8d-e）。在肺轉移裸鼠模型中，shcircTLK1小鼠的肺轉移顯著減少（Fig. 8f-h）。在腫瘤異種移植模型中，過表達CBX4逆轉了shcircTLK1誘導的生長抑制（Fig. 8i-k）。這些體內實驗結果表明circTLK1可能在促進RCC的體內生長和轉移中發揮重要作用。

圖8 circTLK1敲低可抑制體內RCC細胞的生長和轉移

    總之，作者證明了circTLK1通過海綿吸附miR- 136-5p來調節CBX4的表達，從而促進了RCC的生長和轉移(圖8l)。

參考文獻:

    Li Jianfa., Huang Chenchen., Zou Yifan., Ye Jing., Yu Jing., Gui Yaoting.(2020). CircTLK1 promotes the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma by sponging miR-136-5p. Mol. Cancer, 19(1), 103. doi:10.1186/s12943-020-01225-2