Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(PtdIns3K)復(fù)合物的PIK3C3/VPS34亞基是大自噬/自噬的早期關(guān)鍵因子。在這項研究中,我們評估了PIK3C3對T細(xì)胞代謝和功能的貢獻(xiàn)。這篇文章發(fā)表于“Autophagy”,題目為“Autophagy-related protein PIK3C3/VPS34 controls T cell metabolism and function”。
在這篇研究中,我們發(fā)現(xiàn)Pik3c3-31缺陷型T細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞代謝受損,Pik3c3缺陷型CD4+T 細(xì)胞未能分化為T輔助細(xì)胞。這些改變與T細(xì)胞活化時活性線粒體減少水平有關(guān)。此外,有條件的Pik3c3缺陷動物未能產(chǎn)生自身反應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng),對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)有抵抗力。有趣的是,Pik3c3的缺失對動物清除腫瘤轉(zhuǎn)移的能力幾乎沒有影響。
結(jié) 果:
1.Pik3c3基因在T細(xì)胞中的缺失重組基因表達(dá)
為了更好地了解Pik3c3缺失對T細(xì)胞功能的潛在影響,我們產(chǎn)生了Pik3c3f/f,Cd4-Cre小鼠,其在T細(xì)胞中表現(xiàn)出選擇性的Pik3c3消融。我們研究了來自Pik3c3f/f 和pik3c3f/f,Cd4-Cre小鼠的富含F(xiàn)ACS的CD4+和CD8A+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組。RNA測序分析顯示,轉(zhuǎn)錄水平在全基因組范圍內(nèi)發(fā)生了顯著變化。CD4+T細(xì)胞中Pik3c3缺乏顯著誘導(dǎo)或降低基因表達(dá),包括Pik3c3(圖1A)。隨后的途徑富集分析確定了Pik3c3缺陷CD4+T細(xì)胞中受影響有糖酵解/糖異生、氨基酸生物合成、N-聚糖生物合成和cAMP信號途徑(圖1B)。CD8A+T細(xì)胞中Pik3c3缺陷也誘導(dǎo)或減少基因表達(dá),包括Pik3c3(圖1C)。然而,富集分析沒有顯示任何細(xì)胞代謝改變的證據(jù)(圖1D)。相反,受影響最顯著的途徑與唾液分泌、MAPK 信號途徑和麻疹相關(guān)(圖1D)。許多細(xì)胞代謝相關(guān)基因在CD4+T中被調(diào)控超過10倍(圖1E)。我們還觀察到Pik3c3缺陷性CD4+T細(xì)胞中Th1細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Tbx21的表達(dá)降低(圖1E)。相比之下,其他Th細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子如Gata3、Rorc和Foxp3的表達(dá)沒有顯著差異(圖1E)。
2.Pik3c3缺失引起活化T細(xì)胞線粒體功能和代謝的改變
我們之前已經(jīng)證明pik3c3f/f;Cd4-Cre小鼠的外周T細(xì)胞丟失是由于細(xì)胞器的積累和穩(wěn)態(tài)時細(xì)胞凋亡的增加。因此,我們進(jìn)一步研究了PIK3C3在T細(xì)胞克隆擴(kuò)增過程中對T細(xì)胞存活的作用。我們用抗CD3E和抗CD28抗體對Pik3c3f/f和pik3c3f/f;Cd4-Cre小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行了刺激,并用流式細(xì)胞儀測定了刺激后活細(xì)胞的百分比。Pik3c3缺失T細(xì)胞的百分比明顯低于富含Pik3c3 的T細(xì)胞,后者增殖緩慢(圖2A和2B)。由于自噬是維持激活后ATP產(chǎn)生的必要條件,我們接下來評估了自噬失敗對T細(xì)胞代謝的影響。我們用細(xì)胞外流量分析儀測量了活化T細(xì)胞的耗氧率(OCR)和細(xì)胞外酸化率(ECAR)的變化,分析了活化T細(xì)胞的線粒體呼吸和有氧糖酵解。Pik3c3缺乏顯著降低活化的CD4+和CD8A+T 細(xì)胞的OCR和ECAR(圖2C、2D)。這一結(jié)果證實了RNA序列數(shù)據(jù),即與糖酵解和氧化磷酸化相關(guān)的基因被下調(diào)(圖1E)。有趣的是,與CD8A+T細(xì)胞相比,CD4+T細(xì)胞OCR和ECAR的降低更為顯著。
為探討Pik3c3f/f和 pik3c3f/f;Cd4-Cre小鼠T細(xì)胞代謝的不同機(jī)制,我們評估了T細(xì)胞系的線粒體質(zhì)量和功能。與對照T細(xì)胞相比,缺乏Pik3c3的CD4+和CD8A+T細(xì)胞的基礎(chǔ)Mitoview(線粒體膜染色)染色增強(qiáng),表明缺乏Pik3c3時線粒體有積累(圖2E和2F)。在Pik3c3f/f和pik3c3f/f;CD4-Cre小鼠中,CD4+或CD8A+T細(xì)胞的激活導(dǎo)致了有絲分裂染色的顯著增加(圖2E和2F)。然而,與Pik3c3缺陷的CD4+T細(xì)胞相比,Mitoview染色在Pik3c3足夠的CD4+T細(xì)胞中的增加更為顯著。我們假設(shè),Pik3c3缺陷T細(xì)胞代謝減少可能是由于線粒體狀態(tài)的改變和線粒體負(fù)荷。為了測試這一點,我們用四甲基羅丹明乙酯高氯酸鹽(TMRE)對細(xì)胞進(jìn)行染色,發(fā)現(xiàn)與Pik3c3f/f;Cd4 Cre小鼠相比,刺激導(dǎo)致Pik3c3f/f小鼠的CD4+和CD8A+T細(xì)胞線粒體膜電位升高(圖2E和2F)。CD4+T細(xì)胞活化誘導(dǎo)TMRE的增加比CD8A+T細(xì)胞的高。總的來說,這些結(jié)果表明PIK3C3在T細(xì)胞活化過程中維持健康的線粒體負(fù)荷增加需要,特別是在CD4+T細(xì)胞中。
3.T細(xì)胞Pik3c3缺失抑制Th1細(xì)胞分化
先前的研究表明,自噬在不同的T輔助亞群中受到不同的調(diào)節(jié)。因此,我們接下來評估Pik3c3缺乏是否調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞分化。我們在Th1、Th2、Th17和Treg偏斜條件下培養(yǎng)MACS分選的Pik3c3足夠和缺失的CD4+SELL/CD62L+T細(xì)胞,然后用抗CD3E抗體重新激活細(xì)胞,以評估每個亞群的標(biāo)志性細(xì)胞因子或轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)在這些不同極化條件下培養(yǎng)的原始CD4+T細(xì)胞在Pik3c3缺失時對細(xì)胞死亡有不同的敏感性。Pik3c3缺乏的T細(xì)胞在Th1下,Th2和Treg條件下培養(yǎng)更加敏感,而在Th17細(xì)胞培養(yǎng)條件下對細(xì)胞死亡敏感性相對較低(圖3 A和B)。在Th1細(xì)胞條件下,在缺乏Pik3c3的情況下,產(chǎn)生IFNG細(xì)胞的比例顯著降低(圖3C和3D)。然而,在Th2條件下培養(yǎng)的細(xì)胞中, IL4的表達(dá)沒有差異,IL17A在Th17條件下培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)沒有差異,F(xiàn)OXP3在Treg條件下培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)沒有差異,(圖3C和3D)。這些數(shù)據(jù)證實了我們的RNA序列研究中轉(zhuǎn)錄變化的無偏測量,表明減少了Tbx21的表達(dá),但在缺乏CD4+T細(xì)胞中Gata3、Rorc和Foxp3的表達(dá)沒有差異(圖1E)。
4.T細(xì)胞Pik3c3缺乏導(dǎo)致對EAE誘導(dǎo)的抵抗
我們推測Pik3c3缺失抑制自身免疫反應(yīng)的發(fā)展。我們使用多發(fā)性硬化的EAE模型來測試T細(xì)胞中Pik3c3缺失是否導(dǎo)致EAE誘導(dǎo)的抵抗。結(jié)果表明,pik3c3f/f;Cd4-Cre小鼠對EAE完全耐藥,而在同一實驗中,所有pik3c3f/f小鼠均出現(xiàn)EAE征象(圖4A)。我們認(rèn)為pik3c3f/f;Cd4-Cre小鼠對EAE誘導(dǎo)的抗性增加可能與T細(xì)胞啟動減少有關(guān)。因此,我們評估了抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng),發(fā)現(xiàn)在pik3c3f/f;Cd4-Cre小鼠中,MOG 211(髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白)特異性IFNG+CD4+T細(xì)胞顯著減少(圖4B)。IL17+CD4+T細(xì)胞也適度減少,盡管沒有統(tǒng)計學(xué)差異(圖4B)。另外,我們發(fā)現(xiàn)所有的rubcn-/-小鼠都出現(xiàn)了EAE癥狀,與WT對照小鼠相似(圖4C)。這些結(jié)果表明pik3c3f/f;Cd4-Cre小鼠對EAE誘導(dǎo)的保護(hù)作用最有可能不是由有缺陷的非規(guī)范自噬引起的。
為了更好地確定EAE對T細(xì)胞Pik3c3缺乏的抗性,我們用Rosa26-CreERT2小鼠培育Pik3c3f/f小鼠,產(chǎn)生Pik3c3f/f;Rosa26-CreERT2小鼠。從MOG35-55免疫動物獲得的4-OH三苯氧胺處理的ER-Cre+細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移到同源WT(PTPRCa/CD45.1)動物,導(dǎo)致對EAE發(fā)育的保護(hù),而在同一個實驗中,接受載體處理的ER-Cre+細(xì)胞的動物出現(xiàn)EAE跡象(圖4D)。我們隨后測定了小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤白細(xì)胞的頻率。接受4-OH三苯氧胺處理的ER-Cre+細(xì)胞的小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤PTPRCb/CD45.2+細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的比例明顯低于接受載體處理的ER-Cre+細(xì)胞的小鼠(圖4E和4F)。總之,這些數(shù)據(jù)表明,PIK3C3在自身免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)和效應(yīng)階段都具有關(guān)鍵作用。
5.未改變的腫瘤轉(zhuǎn)移易感性
為了確定Pik3c3在腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要性,我們用靜脈注射Lewis肺癌(LLC)細(xì)胞或B16黑色素瘤細(xì)胞對Pik3c3f/f和pik3c3f/f;Cd4-Cre小鼠進(jìn)行了檢測,并監(jiān)測了肺腫瘤的定植情況。有趣的是,與Pik3c3f/f;Cd4-Cre小鼠相比,Pik3c3f/f小鼠具有相似的LLC和B16黑色素瘤腫瘤負(fù)荷(圖5A-C)。為了更好地理解潛在的機(jī)制,我們分析了腫瘤定植肺中的免疫細(xì)胞群。我們在Pik3c3f/f和Pik3c3f/f;Cd4-Cre小鼠的肺中發(fā)現(xiàn)了相似的細(xì)胞總數(shù)。腫瘤的免疫組織學(xué)分析證實pik3c3f/f;CD4-Cre小鼠CD4+T細(xì)胞和CD8A+T細(xì)胞的頻率降低(圖5D)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示, pik3c3f/f;CD4-Cre小鼠CD4+T細(xì)胞、CD8A+T細(xì)胞和Tregs、未改變的B細(xì)胞和MDSCs的頻率顯著降低,而KLRB1C/NK1.1+細(xì)胞增加(圖5E和5F)。CD8A+T細(xì)胞表型分析顯示pik3c3f/f;Cd4-Cre 255小鼠的效應(yīng)細(xì)胞CD44+SELL-T細(xì)胞頻率增加(圖5G)。然而,Pik3c3缺乏并沒有改變PTPRC/CD45+257細(xì)胞對LLC腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤細(xì)胞溶解功能(圖5H和5I)。總的來說,結(jié)果表明,T細(xì)胞中Pik3c3的缺失對效應(yīng)細(xì)胞清除腫瘤轉(zhuǎn)移的功能影響有限。
結(jié) 論:
總之,我們的數(shù)據(jù)揭示了PIK3C3在T細(xì)胞代謝和功能中的關(guān)鍵作用。T細(xì)胞中的PIK3C3在EAE過程中也可能通過典型的自噬依賴途徑參與這些細(xì)胞的致病性。因此,我們的研究對通過靶向PIK3C3治療多發(fā)性硬化和其他自身免疫性疾病的有效免疫療法的發(fā)展具有意義。