鐵死亡是一種新的非凋亡性細胞死亡方式，由鐵依賴性的脂質過氧化物的積累引起。腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）通過分泌多種生物活性物質支持腫瘤的進展和耐藥性。然而，CAFs在調節腫瘤細胞脂質代謝和鐵死亡中的作用仍然是未知的。接下來，小編為大家講解發表于“Molecular Cancer”上的文章“CAF secreted miR-522 suppressesferroptosis and promotes acquired chemo-resistance in gastric cancer”。

    在本研究中，我們應用質譜技術篩選胃癌中鐵死亡相關基因，超離心法分離外泌體，RT-qPCR法檢測CAF分泌的miRNAs。以Erastin誘導鐵死亡，通過測定脂質ROS、細胞活力和線粒體膜電位來評價鐵死亡程度。
結 果：
1）GC中與鐵死亡相關的關鍵基因的篩選
    我們首先用質譜法比較了GC特異性蛋白，發現GC腫瘤組織（T）中的一組蛋白表達明顯低于癌旁組織（P）。ALOX15是導致鐵死亡的關鍵基因之一，呈急劇下降趨勢，而腫瘤組織中USP7和hnRNPA1的水平明顯升高（圖1a）。隨后，測定ALOX15蛋白和mRNA。ALXO15蛋白總體呈下降趨勢，但ALOX15mRNA無明顯變化（圖1b-d）。我們還通過IHC檢測了ALOX15的分布，ALOX15主要在癌旁組織的腺體細胞中表達，少量在腺瘤細胞中表達（圖1e）。根據ALOX15蛋白水平的平均值，將GC患者分為ALOX15高組和ALOX15低組。高水平的ALOX15蛋白與胃癌患者的總生存率（OS）有更好的相關性（圖1f）。脂質ROS是ALOX15產生的一種重要代謝物。在腫瘤組織中脂質ROS的水平明顯降低（圖1g），并且與ALOX15呈正相關（圖1h）。這些數據表明，ALOX15在調節胃腫瘤脂質活性氧生成中起著關鍵作用。

2）外泌體miR-522主要來源于腫瘤微環境中的CAFs
    雖然我們已經證明miR-522在GC中明顯上調，但是miR-522的起源仍然不清楚。分離癌組織中CAFs和癌旁正常成纖維細胞（NFs），檢測原代細胞和外泌體miR-522水平。與NFs相比，CAFs中CAFs、α-SMA、FAP和FSP1的標記物均明顯增加（圖2a和b）。與腫瘤細胞和NFs相比，CAFs中miR-522的濃度最高（圖2c）。NFs、TCs和CAFs的外泌體按上述方法分離并拍攝（圖2d），外泌體的標記物通過WB分析檢測（圖2e）。miR-522在CAF外泌體中的含量最高，其次是TC外泌體（圖2f）。正如預期的那樣，來自CAFs的外泌體miR-522也與ALOX15和脂質ROS呈負相關（圖2g和h）。這些數據表明，GC腫瘤微環境中的exo-miR-522主要由CAFs分泌。

3）CAFs分泌的exo-miR-522抑制GC細胞的鐵死亡
    為探討CAFs來源的exo-miR-522對胃癌細胞鐵死亡的調節作用，分離CAF外泌體并與人胃癌細胞株共培養。SGC7901細胞、MGC803細胞和MKN45細胞分泌的外泌體照片如圖3a所示，這些外泌體還含有CD63、TSG101和Alix（圖3b）。CAFs中miR-522的含量是GC細胞株的6倍，在外泌體中也有同樣的趨勢（圖3c）。CAF外泌體與GC細胞共培養，6h時在SGC7901細胞和MKN45細胞中均檢測到PKH-26 標記的CAF外泌體（圖3d），表明CAFs來源的外泌體能與GC細胞有效融合。CAFs外泌體顯著抑制了GC細胞中ALOX15的表達（圖3e-g）。此外，exo-miR-522被證明能有效抑制erastin誘導的GC細胞脂質ROS積聚和鐵死亡（圖3h，3i）。erastin處理的SGC7901細胞線粒體膜電位明顯升高（圖3j），CAF外泌體部分逆轉了erastin對線粒體的損傷（圖3k）?？傊?，CAFs分泌的外泌體miR-522抑制ALOX15的表達，下調GC細胞的鐵死亡水平。

4）USP7通過穩定hnRNPA1促進miR-522的分泌
    在目前的研究中，hnRNPA1在胃腫瘤組織中上調。IHC分析顯示了USP7、HNNPA1和ALOX15之間的相關性（圖4a）。接下來，我們檢測發現上述12種腫瘤組織的hnRNPA1和USP7在CAFs中高表達（圖4b-d）。此外，hnRNPA1和USP7水平與外泌體miR-522呈正相關（圖4e，4f），提示USP7和hnRNPA1參與CAFs miR-522分泌。此外，與去泛素相關的USP7在增加HRNPA1水平方面起著重要作用（圖4g）。
    為了進一步研究USP7、hnRNPA1和miR-522之間的內在聯系，我們構建了包含hnRNPA1和USP7編碼序列的質粒以及兩個基因的siRNAs。質粒的轉染顯著上調了hnRNPA1和USP7的表達，而siRNAs的應用導致了這兩個基因的顯著減少（圖4h，4i）。在CAFs中，hnRNPA1或USP7的過表達促進外泌體miR-522的表達；然而，這兩個基因的敲除相對降低了外泌體miR-522的水平（圖4j）。拯救實驗表明，過表達的hnRNPA1或USP7部分中和了各自siRNAs對exo-miR-522的影響（圖4h-j）。接下來，在免疫沉淀法的產物中，可以使用抗hnRNPA1抗體檢測USP7，反之亦然（圖4k）。此外，USP7與HRNA1泛素化水平之間呈負相關（圖4l）。總之，這些結果表明USP7通過去泛素化穩定了CAFs中的hnRNPA1，從而增強了外泌體miR-522的分泌。

5）hnRNPA1直接介導CAF中外泌體miR-522
    為了進一步驗證hnRNPA1選擇性地將miR-522包裝成外泌體中的作用，我們利用RBPDB預測了miR522結合蛋白的表達。圖5a顯示了前三個RNA結合蛋白，hnRNPA1得分最高。我們設計了PABPC1和ACO1 siRNAs，PABPC1和ACO1明顯被siRNAs敲除（圖5b）。這些siRNAs的轉染對CAFs中miR-522的表達幾乎沒有影響（圖5c），但是hnRNPA1的下調顯著降低了CAF外泌體miR-522的水平（圖5d）。用生物素標記野生型和突變miR-522，轉染CAFs。結果表明，在使用野生型生物素miR-522產生co-IP時，只檢測到hnRNPA1（圖5e）。另外，Cy3標記的miR522被轉染到CAFs中，來自CAFs的外泌體通過細胞膜與較低的GC細胞融合。Cys-miR-522在SGC7901細胞和MKN45細胞中均能清楚地被檢測到，并且在CAFs中hnRNPA1的沉默阻止了Cys-miR-522從CAFs向GC細胞的轉移（圖5h-k）。這些數據表明hnRNPA1在miR-522進入CAF外泌體的過程中起著重要的中介作用。

6）化學毒性通過激活USP7/hnRNPA1途徑促進CAFs分泌miR-522
    為了獲得CAFs化療誘導的損傷反應，我們檢測了用亞致死劑量順鉑或紫杉醇治療的GC細胞。順鉑和紫杉醇對CAFs細胞活力的抑制作用如圖6a，6b所示。選用8μg/mL順鉑和100 nmol/L紫杉醇作為CAFs的亞致死劑量。結果表明，順鉑或紫杉醇均能促進CAFs中USP7和hnRNPA1的表達（圖6c和d）；化療毒性也增強了hnRNPA1的去泛素化（圖6e和f），從而導致miR-522在外泌體中的表達上調，而對原發性CAFs中miR-522的表達無明顯影響（圖6g）。這一結果表明，化療通過增加USP7的表達和減少hnRNPA1的泛素化，促進外泌體miR-522分泌。
    從經順鉑或紫杉醇處理的CAF中分離的外泌體與GC細胞共培養結果看，它們顯示出比對照CAF外泌體更大的抑制ALOX15蛋白表達的能力，而不影響ALOX15轉錄（圖6h-j）。在SGC7901和MKN45細胞中，順鉑處理的CAF外泌體和紫杉醇處理的CAF外泌體均能更有效地減少脂質ROS的產生并抑制erastin誘導的鐵死亡（圖6k，6l）。在培養基中加入順鉑可導致GC細胞的高死亡率，而順鉑處理的CAF外泌體和紫杉醇處理的CAF外泌體可降低GC細胞的死亡率（圖6m）。這些體外實驗為CAF外泌體在化療過程中降低藥物敏感性提供了證據。

7）USP7/hnRNPA1/miR-522對胃癌生長及化療敏感性的體內調節作用
    在體內評價USP7/hnRNPA1/miR-522軸對腫瘤生長和化療療效的影響。我們用含有shRNAs的慢病毒分別產生了三株敲除USP7、hnRNPA1和miR-522的胃成纖維細胞株，并將這些成纖維細胞株與SGC7901細胞混合用于小鼠皮下腫瘤移植（圖7a）。從第10天開始，每5天給這些荷瘤小鼠注射順鉑或生理鹽水，第30天取出腫瘤。CAFs中USP7、hnRNPA1或miR-522的敲除明顯抑制腫瘤生長，增強對順鉑的敏感性（圖7b-d），但腫瘤中脂質ROS水平上調（圖7e）。另外，USP7的敲除降低了hnRNPA1蛋白水平；CAF中三個基因的抑制導致癌細胞中ALOX15的上調（圖7f-h）。此外，順鉑的治療相對促進了CAFs中USP7/hnRNPA1和癌細胞中ALOX15的表達（圖7f-h），但ALOX15的mRNA變化不大（圖7i）。從這些小鼠中分離出血漿外泌體（圖7j），外泌體miR-522在USP7-KD和hnRNPA1-KD組中水平急劇下降，在miR-522-KD組中最低（圖7k）。細胞凋亡標志物CASP3在CAFs中隨USP7、hnRNPA1和miR-522基因敲除而略有升高（圖7l-m）。綜上所述，這些結果表明USP7/hnRNPA1促進CAFs分泌exo-miR-522，降低腫瘤中脂質ROS水平，促進腫瘤生長。此外，通過阻斷miR-522的分泌，可以提高化療藥物的療效。

8）USP7/hnRNPA1/exo-miR-522通路對腫瘤移植小鼠生存的影響
    USP7、hnRNPA1和miR522的抑制延長了荷瘤小鼠的生存期（圖8a），而順鉑組小鼠的存活率高于生理鹽水組（圖8b）。最后，我們提供了一個示意圖來說明跨細胞信號通路在調控GC細胞鐵依賴性中的生物學作用，包括USP7、HRNPA1、exo-miR-522和ALOX15（圖8c）。

結 論：
    CAFs通過靶向ALOX15和阻斷脂質ROS的積累，分泌外泌體miR-522抑制癌細胞的鐵死亡。由USP7、hnRNPA1、exo-miR-522和ALOX15組成的細胞間通路揭示了GC中獲得性耐藥的新機制。