胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，迫切需要更有效的生物標志物和靶標以進行更好的診斷和治療胃癌。circRNA可作為癌癥的潛在診斷生物標志物，并代表新的治療目標。今日這篇文章和大家一起探索circRNA在胃癌中的功能和潛在機制。
技術路線：

結 果：
1.人胃癌組織中環(huán)狀RNA (circMRPS35)的鑒定與驗證
    RNA測序分析癌組織和鄰近的正常組織中circRNA表達，13個circRNA在胃癌中明顯下調(diào)，有9個上調(diào)。在30對胃癌和鄰近正常組織中驗證表達，發(fā)現(xiàn)源自MRPS35基因的circ_0000384差異最顯著。發(fā)散和聚合引物PCR擴增以及Sanger測序證實circRNA的環(huán)狀結構，circMRPS35具有更高的RNA酶抵抗力，轉(zhuǎn)錄抑制劑Dactinomycin D處理后circMRPS35比MRPS35 mRNA穩(wěn)定。以上表明，circMRPS35是在胃癌組織中低表達的穩(wěn)定circRNA。

2.CircMRPS35表達與胃癌的良好預后相關
    circMRPS35在胃癌組織的表達顯著減少，circMRPS35的表達水平與晚期腫瘤結轉(zhuǎn)移（TNM）分期、淋巴轉(zhuǎn)移和腫瘤大小呈負相關，ROC曲線分析表明circMRPS35可用于預測患者的預后。

3.體外CircMRPS35抑制胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移
    為評估circMRPS35的功能，分析circMRPS35在各種人類胃癌細胞系和GES-1細胞的表達。發(fā)現(xiàn)circMRPS35水平在SGC7901和MKN28細胞中較低。質(zhì)粒pCDH-CMVCircMRPS35轉(zhuǎn)染后，明顯增加，在SGC7901和MKN28細胞中過表達CircMRPS35，抑制細胞生長并誘導細胞周期停滯在G1期，抑制細胞侵襲。siRNA抑制circMRPS35表達，明顯促進細胞增殖、細胞周期加速和侵襲。這些結果驗證circMRPS35可以調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)胃癌細胞的行為。

4.體內(nèi)CircMRPS35抑制癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移
    在體內(nèi)，circMRPS35降低異種移植小鼠模型中的腫瘤生長和重量，circMRPS35過表達的腫瘤中Ki-67和PCNA降低，裸鼠肺中的轉(zhuǎn)移灶降低。shRNA慢病毒抑制CircMRPS35則增加了腫瘤的生長、腫瘤的重量以及Ki-67和PCNA的表達，增加裸鼠肺部轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量。

5.CircMRPS35通過FOXO1和FOXO3a的轉(zhuǎn)錄激活抑制胃癌進展
    circMRPS35敲低后進行RNA序列，GO和KEGG分析表明FOXO信號是circMRPS35參與癌癥調(diào)節(jié)最相關的信號。FOXO家族是進化保守的，包括FOXO1，F(xiàn)OXO3a，F(xiàn)OXO4和FOXO6四個成員。circMRPS35增加FOXO1和FOXO3a的mRNA和蛋白質(zhì)水平，CircMRPS35敲低對FOXO1和FOXO3a的磷酸化沒有影響。circMRPS35改變FOXO1和FOXO3a的靶基因（p21，p27，Twist1，E-cadherin）的表達，F(xiàn)OXO1的減少顯著減弱circMRPS35的促進p21和p27表達，挽救細胞周期停滯并抑制細胞增殖。熒光原位雜交表明circMRPS35主要位于細胞核內(nèi)，circMRPS35增強FOXO1和FOXO3a的啟動子活性。總而言之，circMRPS35通過轉(zhuǎn)錄激活FOXO1和FOXO3a抑制胃癌細胞的行為。

6.CircMRPS35的表達與胃癌組織中的FOXO3a和FOXO1對應
    胃癌組織中FOXO1或FOXO3a表達均顯著下降，F(xiàn)OXO1的表達與呈腫瘤大小負相關，F(xiàn)OXO3a表達與晚期TNM階段、淋巴結轉(zhuǎn)移呈負相關。ROC曲線表明FOXO1和FOXO3a表達可用于預測患者的預后。FOXO1或FOXO3a的低表達與胃癌患者的不良生存密切相關，F(xiàn)OXO1和FOXO3a表達與circMRPS35呈正相關。這些表明circMRPS35介導的FOXO1和FOXO3a信號在胃癌中起關鍵作用。

7.CircMRPS35招募KAT7到FOXO1和FOXO3a基因的啟動子
    進一步研究circMRPS35激活FOXO1和FOXO3a轉(zhuǎn)錄的機制，細胞裂解物與生物素化circMRPS35探針孵育，RNA下拉測定和質(zhì)譜分析參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的蛋白質(zhì)KAT7。在MGC803細胞核中circMRPS35 與KAT7共定位，circMRPS35片段形成多個氫鍵與KAT7殘基相互作用，KAT7（256-315aa）C2H2域?qū)εccircMRPS35的相互作用至關重要。FOXO1和FOXO3a啟動子區(qū)域中H4K5ac，H4K12ac和H3K14ac的表達富集，ChIP證明只有H4K5ac結合到FOXO3a和FOXO1的啟動子區(qū)域，RNA下拉和RIP證明H4K5ac與circMRPS35特異性相互作用，circMRPS35與KAT7和H4K5ac表明circMRPS35與H4K5ac和KAT7相互作用形成三聚體。在circMRPS35 /KAT7/H4K5ac的復合物中，H4K5ac殘基77-84停靠KAT7形成的口袋中，H4K5ac具有α-螺旋基序的殘基54–77與KAT7的563-576位殘基相互作用，circMRPS35直接與FOXO1和FOXO3a啟動子區(qū)域結合。以上表明circMRPS35將KAT7募集到FOXO1和FOXO3a的啟動子。KAT7的敲低減弱circMRPS35增加的FOXO1和FOXO3a基因啟動子處H4K5ac水平，敲低KAT7大大降低circMRPS35誘導的FOXO1和FOXO3amRNA和蛋白質(zhì)表達。以上表明，circMRPS35通過招募KAT7增加了FOXO1和FOXO3a啟動子區(qū)域中的H4K5的乙酰化水平。