神經(jīng)膠質(zhì)細胞源性外泌體miRNA通過下調(diào)基因表達來調(diào)節(jié)器官/組織之間的通訊，從而調(diào)節(jié)發(fā)育和生理功能。但是，尚未正式確定特定miRNA的來源，途徑和功能。在這里，將顯示神經(jīng)膠質(zhì)細胞源性外泌體miR-274非細胞自主調(diào)節(jié)突觸鈕扣和氣管分支的生長。
技術(shù)路線：

1. 飼養(yǎng)第三期幼蟲用于實驗cMyc及其調(diào)節(jié)劑在耐藥中的作用

2. 免疫染色，顯微鏡和圖像處理解剖的三期幼蟲

3. 解剖游走的幼蟲以進行EDC固定的熒光原位雜交（FISH）并檢測前體miR-274

4. 果蠅S2細胞培養(yǎng)物中分離外泌體并進行蛋白質(zhì)印跡

5. 從幼蟲或外泌體組分中提取總RNA進行RT-PCR和實時PCR

6. 游蕩雌性幼蟲RNA測序以及螢光素酶的構(gòu)建和測定

7. 對早期至三分齡幼蟲的行為分析

8. 使用Graphpad Prism v6進行統(tǒng)計分析

研究結(jié)果：
1.神經(jīng)膠質(zhì)細胞需要miR-274來調(diào)節(jié)突觸和氣管生長
    通過透射電子顯微鏡進行的超微結(jié)構(gòu)分析表明神經(jīng)膠質(zhì)-突觸-氣管組織可能代表功能單元，其形成可能受到發(fā)育調(diào)控。篩選了一組miRNA基因敲除突變體，定量分析證實了miR-274活性的缺乏是兩個系統(tǒng)中生長缺陷的原因。同樣也證明缺乏miR-274的幼蟲無法發(fā)育出完整的突觸按鈕和氣管分支。采用了由細胞類型特異性GAL4驅(qū)動程序驅(qū)動的UAS-decoy-mir-274轉(zhuǎn)基因來抑制miR-274功能，證明了對miR-274的神經(jīng)膠質(zhì)抑制足以損害突觸和氣管生長。此外進行了神經(jīng)膠質(zhì)搶救實驗，結(jié)果證明了神經(jīng)膠質(zhì)細胞表達的miR-274促進突觸鈕扣和氣管分支的生長。

2.miR-274前體和成熟形式的表達
    FISH分別檢測了解剖的幼蟲切片中的miR-274的前體或成熟形式。干擾探針在幼蟲大腦中檢測到低背景或非特異性信號。用于檢測miR-274前體的環(huán)形探針在大腦中顯示出明顯的信號。這些信號位于由repo-GAL4驅(qū)動的mCD8-GFP標記的膠質(zhì)細胞中，偶爾檢測到強核信號。相反，在突觸鈕扣和氣管分支中檢測到低背景信號。使用干探針來檢測成熟的miR-274。觀察到了強大而普遍存在的信號。這些信號也在肌肉細胞和突觸鈕扣內(nèi)以及氣管體和分支中檢測到。在mir-274KO突變體對照中未檢測到成熟miR-274的信號。總結(jié)：miR-274前體主要在神經(jīng)膠質(zhì)中合成，并且成熟形式在肌肉，突觸鈕扣和氣管細胞中檢測到。

3.膠質(zhì)細胞中miR-274的外泌體分泌
    在S2細胞提取物中檢測到miR-274。miR-274可能從S2細胞分泌到培養(yǎng)基中。S2細胞培養(yǎng)基分離的外泌體富含miR-274。在外泌體組分中檢測到了外泌體標志物TSG101，Rab11和Syntaxin。在野生型幼蟲的血淋巴中檢測到大量的miR-274，而從mir-274KO突變體分離的血淋巴中則沒有。在來源于野生型對照和突變幼蟲的血淋巴的外泌體組分中檢測到典型的外泌體標記物TSG101，Rab11和Syntaxin。因此，miR-274可以作為循環(huán)外泌體分泌到幼蟲的血淋巴和S2細胞培養(yǎng)基中。檢測神經(jīng)膠質(zhì)細胞可以在血液淋巴中分泌miR-274作為外泌體。我們對mir-274KO突變體中神經(jīng)元和氣管miR-274的表達進行了相同的實驗。僅在整個幼蟲裂解物中檢測到miR-274，但在分離的血淋巴或外泌體組分中未檢測到。通過絕對qPCR對血淋巴瘤中的miR-274水平進行定量。

   
4.從膠質(zhì)細胞中分泌miR-274外泌體需要ESCRT組件，Rab11和Syx1A
    通過repo-GAL4在膠質(zhì)細胞中表達了Rab11RNAi或Syx1ARNAi。從淋巴中分離出來的外泌體中miR-274轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。使用成熟的miR-274探針進行了FISH，，miR-274信號描繪了鈕扣狀的形態(tài)，并在肌肉和氣管細胞中呈強烈的點狀。在Rab11或Syx1A的膠質(zhì)細胞敲低后未檢測到這些miR-274信號。Rab11或Syx1A的膠質(zhì)基因敲低導致突觸鈕扣和氣管分支的生長減少。敲除ESCRT-I復合物的TSG101和ESCRT-III復合物的Shrb，膠質(zhì)中TSG101或Shrb的RNAi敲除可有效抑制突觸和氣管生長。通過repo-GAL4在膠質(zhì)細胞中特異性表達TSG101RNAi或shrbRNAi時，從淋巴液分離出的外泌體中miR-274的水平降低。這些結(jié)果強烈表明，miR-274是作為外泌體的貨物分泌的，被釋放到血淋巴中以調(diào)節(jié)突觸和氣管的生長。

5.Sprouty作為miR-274調(diào)控的靶基因
    搜索具有miR-274靶位點并在mir-274KO幼蟲中表達上調(diào)的基因。在最終的候選基因中，sty mRNA的3’UTR包含一個可識別miR-274的靶位點，具有靶向3'UTR的精確或錯配的miR-274序列。當與miR-274共轉(zhuǎn)染時， miR-274靶向序列下調(diào)了報道分子活性。sty mRNA的表達可能受miR-274通過其3'UTR靶向序列的調(diào)控。在mir-274KO幼蟲中檢測到了更高的sty轉(zhuǎn)錄水平。通過進行免疫染色，Sty受miR-274調(diào)節(jié)。檢測突觸終扣和野生型對照的氣管分支的Sty的表達，Sty水平都得到了增強。這由Sty免疫熒光強度的定量支持。在肌肉細胞中，Sty表達也被上調(diào)，表明miR-274可能在多個組織中發(fā)揮系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用。與野生型對照相比，mir-274KO的突觸鈕扣和氣管細胞中dpERK的水平大大降低，dpERK水平的下調(diào)也取決于Sty。在肌肉中也檢測到dpERK水平的恢復。減少miR-274突變體中的sty基因劑量可抑制兩種生長表型。這些結(jié)果表明miR-274抑制Sty表達，從而導致MAPK活化以促進突觸鈕扣和氣管分支的生長。

6.膠質(zhì)細胞源性miR-274靶向突觸鈕和氣管內(nèi)的Sty，以調(diào)節(jié)其生長
    首先在repo> decoy-mir-274幼蟲中進行了免疫染色，該幼蟲的突觸和氣管生長降低了。將miR-274捕獲在膠質(zhì)細胞中會導致突觸后的bout和氣管分支的Sty水平更高。檢測到這兩個位點的dpERK水平降低。發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細胞拯救后，Sty降低，dpERK水平升高，并伴有突觸鈕扣數(shù)量增加和氣管分支。這些結(jié)果說明膠質(zhì)細胞表達的miR-274到達目標位點，以下調(diào)Sty表達并促進突觸鈕扣和氣管分支的生長。最后，我們發(fā)現(xiàn)，該外來體生物發(fā)生，運輸和釋放由Rab11，Syx1A，TSG101和SHRB的膠質(zhì)擊倒的中斷也引起麥粒腫上調(diào)和下調(diào)dpERK突觸終扣和氣管細胞。

7.miR-274調(diào)節(jié)幼蟲缺氧反應
    通過測定mir-274KO突變體的缺氧逃逸反應，當暴露于低氧環(huán)境中時，只有大約20％的對照幼蟲在5分鐘內(nèi)通過逃離食物來源做出了強烈反應，到10分鐘時，這一比例增加到幾乎40％，接近15分鐘后達到50％。相比之下，近50％的mir-274KO突變體在5分鐘后表現(xiàn)出強烈的缺氧反應，在10和15分鐘時表現(xiàn)出約60％的低氧反應。當我們在常氧環(huán)境下分析時，沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異，幾乎所有幼蟲（> 95％）都留在食物中。此外，證實了低氧誘導的反應不是由于幼蟲運動能力的差異所致，因為我們觀察到了mir-274KO突變體和對照之間的爬蟲長度相當。mir-274KO幼蟲確實對較低的氧氣含量具有更高的響應能力。進行了搶救實驗，以檢查正常幼蟲缺氧反應是否需要膠質(zhì)細胞表達的miR-274。與攜帶repo-GAL4或UAS-mir-274轉(zhuǎn)基因的純合子mir-274KO突變體相比，攜帶repo-GAL4和UAS-mir-274轉(zhuǎn)基因的純合子mir-274KO突變體顯示出明顯降低的缺氧反應。
    通過突變進行了Sty的遺傳抑制，發(fā)現(xiàn)在純合的mir-274KO突變體中引入sty突變體等位基因幾乎完全抑制了缺氧逃逸反應的增強。在不存在miR-274的情況下，sty突變等位基因也可恢復氣管分支，因此該結(jié)果支持氣管分支與缺氧逃逸反應相關(guān)。

總 結(jié)：

    在這項研究中，作者探索了果蠅幼蟲神經(jīng)肌肉接頭（NMJ），其中軸突末端分支形成帶有肌肉膜的突觸鈕扣。我們證明NMJ還非常重視氣管末端分支，使其成為研究神經(jīng)和血管協(xié)調(diào)發(fā)育的理想系統(tǒng)。作者篩選了一組miRNA敲除突變體，并確定mir-274突變體在突觸和氣管生長中均具有缺陷。通過熒光原位雜交（FISH），表明miR-274前體在膠質(zhì)細胞中表達，成熟形式被普遍檢測。一致地，在膠質(zhì)細胞中需要miR-274來進行突觸和氣管生長。可以在幼蟲循環(huán)系統(tǒng)的血淋巴中檢測到miR-274的神經(jīng)膠質(zhì)表達。確實，如遺傳分析和生化分級分析所示，miR-274被分泌為外泌體貨物。我們鑒定出一個miR-274靶標發(fā)芽（sty），該靶標在sty轉(zhuǎn)錄本的3'UTR中包含一個靶標位點，并表明神經(jīng)膠質(zhì)miR-274的表達可誘導突觸管和氣管分支中的Sty下調(diào)和MAPK活化。有趣的是，氣管分支較少的mir-274突變體對缺氧過敏，并且兩種表型均被抑制。