盡管MIR516A被報道在多種腫瘤中被下調(diào)并起到抑癌作用，但它的表達及其對膀胱癌（BC）的潛在作用尚不清楚。小編為大家介紹最近發(fā)表于“Autophagy”上的文章“Oncogenic role of MIR516A in human bladder cancer was mediated by its attenuating PHLPP2 expression and BECN1-dependent autophagy”。

    我們發(fā)現(xiàn)MIR516A在人BC組織和細胞系中顯著上調(diào)，而MIR516A表達的抑制減弱了BC細胞體外單層生長和體內(nèi)異種移植瘤生長，并伴隨著PHLPP2的表達增加。進一步的研究表明，MIR516A能夠直接與PHLPP2 mRNA的3’-非翻譯區(qū)結(jié)合。PHLPP2在MIR516A抑制細胞中的表達下調(diào)可能逆轉(zhuǎn)BC細胞的生長，提示PHLPP2是MIR516A下游的一個介導因子，可能參與MIR516A的致癌作用。PHLPP2能間接介導BECN1/Beclin1的穩(wěn)定，從而促進BECN1依賴性的自噬，抑制BC腫瘤細胞生長。此外，通過減弱MIR516A而增加的自噬導致了體內(nèi)異種移植瘤形成的顯著抑制。
結(jié)果：
1.MIR516A是BC細胞體外和體內(nèi)生長必需的
    為了檢測MIR516A在人BCs中的表達模式，我們采用定量PCR方法分析了MIR516A在新鮮臨床BC組織中的表達。如圖1A所示，MIR516A在BC組織中的表達顯著高于配對的鄰近非腫瘤組織。此外，我們還觀察到MIR516A在人膀胱癌細胞系（TCCSUP、UMUC3、J82和RT112）中的過度表達，與在人永生正常尿上皮細胞系UROtsa中的表達相比（圖1B）。為了確定MIR516A的上調(diào)是否在人BC的生長中起作用，我們將MIR516A海綿抑制劑（MIR516Ai）質(zhì)粒穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到兩個BC細胞系UMUC3和J82中。結(jié)果表明，海綿抑制劑結(jié)構(gòu)顯著降低MIR516A水平（圖1C）。在相同的實驗條件下，MIR516A的抑制作用顯著地降低了UMUC3和J82細胞的單層生長（圖1D，E），表明MIR516A促進了BC細胞的生長。軟瓊脂試驗結(jié)果顯示，抑制MIR516A也會損害UMUC3和J82細胞的錨定獨立生長（圖1F，G）。這些結(jié)果提示MIR516A不僅在人BCs中高表達，而且在BC細胞的生長中起致癌作用。除體外實驗外，我們還評估了MIR516A對裸鼠移植瘤模型中J82和UMUC3細胞致瘤性的影響。結(jié)果表明，抑制MIR516A的表達也能抑制裸鼠移植瘤細胞株UMUC3的生長（圖1H），UMUC3-MIR516A I組移植瘤的重量明顯低于UMUC3載體對照組。MIR516A對J82細胞轉(zhuǎn)染的異種移植BC細胞生長的調(diào)節(jié)作用也一樣（圖1H，I）。

2.MIR516A與PHLPP2 mRNA的3’ -UTR結(jié)合并下調(diào)其在人BC細胞中的蛋白表達
    為了闡明MIR516A促進BC細胞生長的作用機制，我們利用TargetScan 7.2軟件對MIR516A可能的靶向候選基因進行了分析。綜合分析結(jié)果顯示，在ACTG2、ETS2和PHLPP2 mRNA的3’-UTR中可能存在MIR516A的結(jié)合位點，如圖2A所示。為了鑒定MIR516A調(diào)控功能的相關(guān)基因，我們檢測了相應蛋白在UMUC3和J82細胞系中的表達。如圖2B所示，MIR516Ai對PHLPP2上調(diào)，ACTG2下調(diào)的抑制作用，對UMUC3和J82細胞中ETS2的表達沒有影響。鑒于PHLPP2是一種特性良好的腫瘤抑制因子，我們穩(wěn)定地將HA-PHLPP2轉(zhuǎn)染到UMUC3細胞中，并且PHLPP2的異位表達顯著抑制了UMUC3細胞的錨定獨立生長（圖2C，D）。為了進一步探討MIR516A調(diào)控PHLPP2表達的機制，我們構(gòu)建了PHLPP2 mRNA 3’ -UTR熒光素酶報告子的野生型和突變型（MIR516A結(jié)合位點突變），如圖2A所示。對熒光素酶活性的評估表明，與載體對照轉(zhuǎn)染物相比，其抑制劑對MIR516A的抑制提高了PHLPP2 mRNA 3’ -UTR熒光素酶活性（圖2E，F(xiàn)）。MIR516A結(jié)合位點的點突變完全消除了MIR516A抑制劑對UMUC3和J82細胞誘導PHLPP2 mRNA 3?-UTR熒光素酶活性的影響（圖2E，F(xiàn)）。為了進一步研究MIR516A調(diào)控PHLPP2的分子機制，我們通過實時PCR測定了其mRNA水平（圖2G）。結(jié)果導致我們排除了MIR516A在RNA降解水平上影響PHLPP2表達的可能性，因為MIR516A不影響PHLPP2 mRNA的表達（圖2G）。因此，我們預期MIR516A通過抑制其蛋白翻譯而下調(diào)PHLPP2。為了確定PHLPP2是否是MIR516A在MIR516Ai對BC細胞錨定依賴性生長影響中的下游介質(zhì)，通過轉(zhuǎn)染針對不同PHLPP2序列的shRNAs，降低了PHLPP2在UMUC3-MIR516Ai細胞中的表達。PHLPP2基因敲除增加UMUC3-MIR516A I細胞的錨定獨立生長（圖2H，I），提示PHLPP2是MIR516A的直接下游靶點，MIR516A誘導的PHLPP2基因下調(diào)在MIR516A促進BC細胞生長中起作用。

3.MIR516A對人BC細胞自噬誘導和錨定非依賴性生長的抑制作用
    為了探討MIR516A在人BC生長調(diào)控中的作用機制，我們將MIR516Ai細胞的自噬狀態(tài)與對照載體細胞進行了比較。結(jié)果表明，MIR516A i對MIR516A的抑制作用可誘導UMUC3和J82 BC細胞的自噬（圖3A）。這一觀點得到了LC3點的形成（圖3B-D）和MIR516Ai-BC轉(zhuǎn)染體中觀察到的自溶體（圖3E，F(xiàn)）的支持。MIR516Ai細胞中PHLPP2基因敲除顯著降低自噬水平（圖3G-I）。為了確定自噬誘導在MIR516Ai誘導的BC細胞生長抑制中的作用，采用自噬通量溶酶體抑制劑bafilomycin A1（BAF）。BAF對自噬的破壞明顯累積了LC3-II水平（圖3K），并逆轉(zhuǎn)了對UMUC3-MIR516Ai和J82-MIR516Ai細胞錨定獨立生長的抑制（圖3L，M）。這些結(jié)果表明MIR516A抑制人BC細胞自噬，進一步介導其促進BC細胞生長。

4.BECN1的抑制介導MIR516A對人BC細胞自噬的抑制
    為了闡明MIR516A介導的自噬抑制機制，我們研究了MIR516Ai對ATG蛋白的潛在作用。MIR516Ai的過度表達特異性上調(diào)了BECN1，對BC細胞中的其他自噬蛋白沒有類似的影響（圖4A，B）。與無義轉(zhuǎn)染物相比，在UMUC3細胞和UMUC3-MIR516Ai轉(zhuǎn)染物中PHLPP2的敲除始終減弱BECN1的表達（圖4C）。這些結(jié)果表明，MIR516A對BECN1有抑制作用，BECN1的抑制作用可能與MIR516A在人BC細胞中的過度表達有關(guān)。通過western blotting對穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體進行鑒定，并進一步探索。BECN1過度表達顯著增加了LC3從LC3-I到LC3-II的轉(zhuǎn)化率（圖4D）。BECN1過表達也抑制了細胞的錨定獨立生長（圖4E，F(xiàn)）。接下來，使用靶向人BECN1的shRNAs來抑制內(nèi)源性BECN1在J82-MIR516Ai細胞中的表達（圖4G）。結(jié)果表明，BECN1表達的敲除降低了LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化、斑點的形成和自溶體的形成（圖4H-J），表明BECN1確實在人BC細胞MIR516Ai異位表達誘導的自噬中起作用。如圖4K，L所示，BECN1基因敲除也挽救了J82-MIR516Ai細胞的錨定獨立生長。這些結(jié)果表明，MIR516A抑制導致BECN1誘導，介導自噬，進而抑制人BC細胞的錨定獨立生長。

5.MIR516A-PHLPP2級聯(lián)促進cul4a介導的BECN1蛋白降解
    BECN1在酵母中也稱為ATG6，是自噬起始和其他生物過程的關(guān)鍵蛋白。作為評估PHLPP2基因敲除細胞中BECN1下調(diào)機制的先決條件，首先用qRT-PCR檢測BECN1的mRNA水平。如圖5A所示，PHLPP2基因敲除對MIR516Ai表達細胞中的BECN1 mRNA水平?jīng)]有影響，表明MIR516A-PHLPP2軸不調(diào)節(jié)BECN1轉(zhuǎn)錄或mRNA穩(wěn)定性。因此，我們研究了MIR516Ai對BECN1蛋白降解的潛在影響。與對照UMUC3-MIR516Ai無義細胞相比，PHLPP2基因敲除增加了BECN1蛋白降解率（圖5B-D）。為了進一步研究PHLPP2介導的抑制BECN1蛋白降解的分子機制，我們進行共免疫沉淀和質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析結(jié)果表明，PHLPP2可能不會直接與BECN1相互作用和影響B(tài)ECN1。然而，經(jīng)過對免疫沉淀蛋白候選物的仔細研究和初步驗證，我們發(fā)現(xiàn)E3泛素蛋白連接酶的幾個核心組分，包括CUL3、CUL4A和CUL4B，在我們的系統(tǒng)中顯示出更高的肽譜匹配值（圖5E）。為了進一步驗證MIR516A及其下游PHLPP2對BECN1的影響是否真的依賴于CUL4B、CUL4A或CUL3，我們首先檢測了這些蛋白質(zhì)表達水平的變化。如圖5F所示，MIR516A-PHLPP2級聯(lián)可以調(diào)節(jié)CUL4A，但對CUL3和CUL4B的表達沒有明顯影響，提示CUL4A可能是PHLPP2抑制BECN1蛋白降解的關(guān)鍵因素（圖5G）。此外，異位CUL4A表達顯著促進BECN1蛋白降解，而CUL4A基因敲除顯著降低BECN1蛋白降解（圖5I-J）。這些結(jié)果表明MIR516A-PHLPP2級聯(lián)主要通過CUL4A依賴機制促進BECN1蛋白降解。

6.抑制MIR516A增加體內(nèi)移植瘤中PHLPP2和BECN1的表達并下調(diào)MKI67的表達
    為了確定MIR516A是否在體內(nèi)對PHLPP2和BECN1起下調(diào)作用，我們用IHC評估了J82-MIR516Ai異種移植瘤中PHLPP2和BECN1的表達，并與J82載體異種移植瘤進行了比較。結(jié)果顯示，與注射J82載體細胞產(chǎn)生的異種移植瘤相比，J82-MIR516Ai異種移植瘤中這些蛋白的表達顯著上調(diào)（圖6A-C）。PHLPP2的表達與裸鼠MIR516A抑制組織中BECN1的表達呈正相關(guān)（圖6E）。我們還確定MKI67/Ki-67是腫瘤細胞增殖的生物標志物。如圖6A、C所示，在MIR516A抑制劑異種移植裸鼠組織中，MKI67陽性BC細胞持續(xù)減少?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明MIR516A通過結(jié)合PHLPP2 mRNA的3’-UTR上調(diào)PHLPP2，導致CUL4A介導的BECN1蛋白降解減少，進一步增加BECN1介導的自噬，從而抑制BC生長（圖6F）。

結(jié)論：
    綜上所述，目前的研究結(jié)果確定了一個新的MIR516APHLPP2-CUL4A-BECN1自噬途徑參與MIR516A促進BC的體內(nèi)外生長。我們發(fā)現(xiàn)MIR516A通過直接結(jié)合其mRNA的3’-UTR而下調(diào)PHLPP2蛋白，而下調(diào)的PHLPP2通過促進BECN1蛋白降解進一步降低BECN1的表達，從而抑制自噬，促進人BC細胞的生長。