腫瘤抑制因子p53轉錄激活靶基因，在應激狀態下抑制細胞增殖。p53也與原癌基因Myc的抑制有關，但機制尚不清楚。因此，小編和大家分享一篇近期發表于molecular cell上的文章“p53 Activates the Long Noncoding RNA Pvt1b to Inhibit Myc and Suppress Tumorigenesis”。在這里，我們確定了Pvt1b，一種lncRNA Pvt1的p53依賴性亞型，表達了Myc下游的50kb，它是由DNA損傷或致癌信號引起的，并在其轉錄位點附近積累。我們研究表明，在不改變基因座染色質組織的情況下，Pvt1b RNA的產生對于抑制順式Myc轉錄是必要且充分的。抑制Pvt1b增加Myc水平和轉錄活性，促進細胞增殖。此外，在肺癌小鼠模型中，Pvt1b缺失加速了腫瘤生長。這些研究結果表明，Pvt1b在p53和Myc轉錄網絡的交叉點發揮作用，增強p53的抗增殖活性。

結果：
1.p53在基因毒性和致癌應激條件下抑制Myc
    為了深入了解p53抑制Myc的機制，我們模擬p53依賴的應激反應。為了模擬細胞對基因毒性應激的反應，我們使用野生型小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs)，用基因毒性藥物Doxo處理（圖1A）。我們觀察到，在Doxo處理24小時后，p53轉錄程序的激活導致p21的3倍誘導，同時Myc RNA和蛋白水平降低（圖1B，C）。我們還發現，在小鼠肺腺癌細胞系中，p53激活是由腫瘤基因應激，以他莫西芬-CreER依賴性恢復內源性p53表達為模型的，同樣導致p21的激活和Myc RNA和蛋白質表達的下降（圖1D-F）。在暴露于輻照6 Gy的腸道上皮細胞中，Myc抑制率為39%±5%（圖1G-H）。接著為了闡明p53激活導致Myc抑制的機制，我們檢查了p53是否與Myc位點相關。我們觀察到，在Doxo處理的MEFs和tamo處理的KPR細胞中，應力依賴性的Myc抑制伴隨著p53與位于Myc下游50 kb處的遠端p53RE的結合（圖1I）。與p53依賴相一致，p53存在的MEFs中，Myc RNA和蛋白水平的變化是存在的（圖1J，1K）。此外，Myc RNA水平的降低在p53激活4h后可以檢測到，與Myc蛋白水平的減少相吻合（圖1L和1M）。使用Cycloheximide抑制蛋白翻譯表明，壓力的存在并未顯著影響Myc蛋白的穩定性（圖1N）。

2.Myc抑制與Pvt1b的激活相關
    考慮到lncRNAs可以順式調控鄰近基因的轉錄，我們檢測了Pvt1是否在脅迫時起到了限制Myc表達的作用（圖2A）。我們觀察到經Doxo處理的MEFs中Pvt1b的誘導率為3.1±0.2倍（圖2B），經Tam處理的KPR細胞中Pvt1b的誘導率為38±6倍(圖2C)。為了進一步鑒定Pvt1位點產生的轉錄本，我們使用位于1a或1b外顯子的正向引物和位于5外顯子的反向引物進行RT-PCR。我們發現了廣泛的選擇性剪接的證據，證實了含有外顯子1b的突變是由p53誘導的，而含有外顯子1a的突變是組成性表達的（圖2D和2E）。盡管存在剪接異質性，但初期RNA測序顯示，僅通過使用外顯子1b和外顯子1a，應力誘導的Pvt1b與本構性表達的Pvt1a有所不同，并表現出與下游外顯子類似的剪接模式（圖2F）。

3.Pvt1b在Pvt1-Myc位點周圍的染色質中積累
    為了深入了解Pvt1b的潛在調控功能，我們進行了單分子RNA熒光原位雜交。我們觀察到Pvt1a和Pvt1b在依托泊苷（Etop）處理的MEFs中主要表現為2點或4點核模式，分別反映了細胞周期的G1期或S/ G2期（圖3A）。Pvt1a和Pvt1b在經Tam處理的KPR細胞中形成較大的云團（圖3B）。值得注意的是，含有Pvt1a和Pvt1b的位點與新生Myc內含子特異性信號共定位，也與新生的Pvt1轉錄本共定位（圖3C-3F）。這些結果使我們得出結論，轉錄后，Pvt1a和Pvt1b保留在圍繞Pvt1-Myc位點的染色質上。亞細胞分餾分析證實了這兩種Pvt1變體在染色質組分中均有富集（圖3G）。

4.Pvt1b RNA抑制了Myc水平
    基于Pvt1b的應力依賴性表達及其局部染色質積累，我們推測Pvt1b可能通過RNA依賴性機制參與Myc的抑制。為了直接驗證這一假設，我們設計了三個針對1b外顯子的獨立反義寡核苷酸（ASOs）（圖4A）。我們使用無目標的ASO作為陰性對照。由于ASOs會導致共轉錄RNA的裂解和降解，ASO1、ASO2和ASO3會顯著下調Pvt1a和Pvt1b（圖4B）。接下來，我們研究了Pvt1靶向ASOs對Myc表達水平的影響。在未處理的MEFs中，與CON樣本相比，在ASO病例中，Myc RNA和蛋白水平沒有發生顯著變化， （圖4C，4D）。與預期一樣，使用Doxo治療后，對照的MEFs的Myc RNA和蛋白水平顯著下降。另一方面，我們發現以pvt1為靶點的ASOs完全挽救了應力誘導的Myc RNA和蛋白的下調。這些發現表明，p53對Pvt1b的轉錄激活是Myc在應激狀態下抑制的必要條件。為了檢測Pvt1b是否能充分抑制Myc，我們使用CRISPR-SAM系統激活p53缺陷細胞內源性Pvt1b的表達。我們分別設計了針對Pvt1a和Pvt1b啟動子的A1和A2 dRNA-MS2（圖4E）。與非靶向對照相比，使用A1的CRISPRa在不改變Pvt1b水平的情況下誘導了1.6倍的Pvt1a，而使用A2導致了20倍的Pvt1b活化（圖4F）。接下來，我們檢測了內源性Pvt1a和Pvt1b的激活對Myc水平的影響。p53修復后，Pvt1b的激活并沒有進一步下調Myc水平，這說明Pvt1b的作用是在p53的下游（圖4G）。另一方面，Pvt1b的激活不足以抑制Myc蛋白水平，這為在轉錄后水平獨立輸入Pvt1b提供了可能（4H）。然后，為了區分順式和反式的活性，我們通過轉染含有外顯子1a-10（1a）或1b-10（1b）的cDNA構建物來檢測外源性的Pvt1a和Pvt1b是否會影響Myc的表達（圖4I）。我們觀察到Pvt1a的過表達為6.5倍，而Pvt1b的過表達為23倍，與CRISPRa誘導的過表達相當（圖4J）。然而，我們發現外源運輸的Pvt1a或Pvt1b對Myc RNA或蛋白水平沒有顯著影響，這與反式運輸的影響相反（圖4K、4L）。

5.Pvt1b的遺傳抑制逆轉應力誘導的Myc下調
    為了研究Pvt1b對p53抑癌途徑的功能貢獻，我們開發了一種基因方法，通過改變表達所需的p53RE來特異性抑制Pvt1b的表達。我們通過Sanger測序證實了p53RE的突變，并通過染色質免疫沉淀證實了?RE突變將p53的結合降低了15倍（圖5A，5B）。通過qRT-PCR，與對照組相比，?RE細胞中的Pvt1b水平被顯著抑制（圖5C），而通過smRNA-FISH，我們觀察到經Tam處理的?RE KPR細胞中Pvt1b特異性信號的丟失（圖5D，5E）。這些觀察使我們得出結論，Pvt1b相關的p53RE突變導致了應力依賴性Pvt1b活化的有效消除。接下來，我們通過qRT-PCR和免疫印跡法檢測了?RE突變以及由此導致的Pvt1b表達缺失對細胞應激反應中Myc水平的影響。在Con KPR群體、KPR克隆和MEF系中，暴露于致癌或基因毒性應激導致的Myc RNA和蛋白水平預期顯著下降（圖5F-H）。與非應激細胞相比，?RE KPR群體、KPR克隆和MEF系暴露于應激并不導致Myc RNA水平顯著下降，這與ASO數據一致。這些結果為Pvt1b調控p53下游的Myc RNA水平提供了獨立的遺傳驗證。

6.Pvt1b抑制了Myc轉錄活性和細胞體外增殖
    通過分析?RE突變對未處理、Doxo處理的?RE和Con MEFs的總RNA的基因表達的影響，我們證實Myc是Pvt1b應對應激的調控靶點（圖6A）。接下來，為了測試Pvt1b是否在轉錄水平或轉錄后水平發揮作用，我們對未處理和經Tam處理的?RE和Con KPR細胞新生RNA進行了測序。我們發現，與Con+Tam KPR細胞相比，?RE+Tam細胞中新生的Myc轉錄本顯著上調（圖6B，6C）。這些數據表明，Pvt1b的產生促進了Myc的轉錄抑制。接下來，我們通過檢測196個Myc靶基因中Pvt1b缺失的后果，探討Myc RNA水平的變化如何影響Myc轉錄程序。與隨機產生的一組表達水平相當的對照基因相比，我們發現MEFs和KPR細胞中Myc靶點的水平顯著升高（圖6D，6E）?？紤]到Myc靶基因包含促進細胞生長的因子，我們將突變細胞的增殖與對照組進行了比較。與對照組相比，Pvt1b表達的丟失導致細胞增殖和集落形成顯著增加（圖6F，6G）。這些數據表明，Pvt1b通過介導p53功能的特異性來抑制細胞的體外增殖。

7.Pvt1b的腫瘤特異性抑制促進了體內的腫瘤生長
    為了闡明Pvt1b是否在體內介導p53功能的某些方面，我們對Pvt1b相關的p53RE進行了腫瘤特異性誘變（圖7A）。Sanger測序證實了在UGPC-?RE感染動物中成功突變了pvt1b相關的p53RE（圖7B）。接下來，我們檢查了感染UGPC-Con、UGPC-p53KO和UGPC-?RE病毒的小鼠肺部的HE切片，并在腫瘤發生16周后處死。組織病理學分析顯示，在感染UGPC-Con的動物中，所有的腫瘤都表現出了1級特征。相比之下，70%的表達UGPC-p53KO的腫瘤以非典型核、間質增生和向低分化表型轉化為特征，并被劃分為2級或3級（圖7C，7D）。另一方面，腫瘤面積相對于總肺面積的定量顯示，UGPC-?RE小鼠的腫瘤負荷較對照組小鼠顯著增加（圖7 E）。值得注意的是，p53RE編輯的小鼠的腫瘤負荷與UGPC-p53KO小鼠的腫瘤負荷相當（圖7E）。這些發現表明，Pvt1b在很大程度上介導了p53下游的生長抑制功能，尤其是在疾病的癌前病變階段。與UGPC-Con小鼠相比，感染UGPC-?RE的動物的腫瘤負荷增加并不是由于細胞凋亡減少。相反，腫瘤負荷的增加可能是由于增殖的增強。在Pvt1b缺陷腫瘤中，來自UGPC-?RE感染動物的腫瘤的磷酸化組蛋白H3 陽性的有絲分裂細胞明顯多于來自UGPC-Con感染小鼠的腫瘤（圖7F，7G）。最后，為了研究Pvt1b是下游作用還是獨立于p53，我們進行了上位實驗。我們分析了UGPC-Con或UGPC-?RE病毒在腫瘤發生12周后的腫瘤負荷。與上述結果一致，我們觀察到UGPC-?RE感染小鼠與UGPC-Con感染的KC動物相比，腫瘤負荷顯著增加。相反，我們發現感染UGPC-?RE和UGPC-Con的KPC動物的腫瘤負荷沒有顯著差異。感染UGPC-?RE的KC小鼠與感染UGPC-Con的KPC小鼠的腫瘤負荷差異無統計學意義（圖7H）。這些結果表明，Pvt1b和p53通過一個共同 的途徑增強了癌前腫瘤的擴散。

結論：
    保守的lncRNA亞型Pvt1b是一種位點特異性的轉錄調節因子，在p53介導的應激反應中抑制Myc的轉錄。Pvt1b RNA的產生抑制細胞增殖和腫瘤生長，揭示了這種癌癥相關的lncRNA的腫瘤抑制活性。