導(dǎo)語：
   新興證據(jù)表明，環(huán)狀RNA（circRNA）在腫瘤中異常表達(dá)，可以作為癌癥的預(yù)后標(biāo)志物。但是，circRNA在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的表達(dá)模式和臨床意義仍然不清楚。在這項(xiàng)研究中，分析了10對肺腺癌(LUAD)和鱗狀細(xì)胞癌(LUSC)患者中核糖體RNA缺失和富集circRNA的RNase R消耗后環(huán)狀RNA的表達(dá)情況。從而探索circRNA在NSCLC中的重要診斷潛力。

技術(shù)路線：
1.人肺腫瘤及其鄰近的正常組織的收集與獲取
2.人肺腫瘤及其鄰近正常組織中的CircRNA分析
3.鑒定和驗(yàn)證LUAD和LUSC組織中差異表達(dá)的circRNA
4.circRNA的驗(yàn)證和定量，circRNA用于NSCLC診斷的潛在生物標(biāo)志物

研究結(jié)果：
1、人肺腫瘤及其鄰近正常組織中的CircRNA分析
   RNase R消化后，從NSCLC腫瘤及其相應(yīng)的正常組織中提取10對RNA樣品，進(jìn)行高通量RNA測序。在所有5個(gè)程序中總共發(fā)現(xiàn)了17,952個(gè)circRNA，其中近98.84％包含至少2個(gè)獨(dú)特的反向拼接reads（圖1a，附圖S1a）。可以觀察到，這些重疊的circRNA普遍存在于整個(gè)基因組區(qū)域（圖1b）。如圖1c所示，與篩選出的circRNA相對應(yīng)的將近60.8％的宿主基因可以產(chǎn)生至少2個(gè)circRNA。盡管無處不在整個(gè)基因組區(qū)域，但大多數(shù)circRNA都是從外顯子區(qū)域反向剪接的，主要（77.4％）由2-5個(gè)外顯子組成（圖1d）。此外，大多數(shù)circRNA的長度（91.7％）在200至1200個(gè)核苷酸之間（圖1e；附加文件2：表S5）。在這些篩選出的circRNA中，已經(jīng)在circBase數(shù)據(jù)庫中記錄了15,359個(gè)，其中包含140,790個(gè)人類circRNA[5]，因此2593個(gè)被認(rèn)為是新穎的（圖1f）。

2、鑒定和驗(yàn)證LUAD和LUSC組織中circRNA的差異表達(dá)
   比較NSCLC腫瘤中circRNA的表達(dá)與其相應(yīng)的正常組織中的circRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)50個(gè)circRNA在LUAD組織中差異表達(dá)，校正后的p值≤0.05，倍數(shù)變化≥2（圖2a，附加文件3：圖S2a）。使用相同的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，觀察到172個(gè)circRNA在LUSC組織中具有明顯的差異表達(dá)（圖2a，附加文件3：圖S2b），并且26個(gè)circRNA在LUAD和LUSC組織中均差異表達(dá)（圖2b）。為了驗(yàn)證，使用跨越各自連接位點(diǎn)的F1 / R1特異性異源引物組對每個(gè)circRNA進(jìn)行PCR（圖2c和g，附加文件3：圖S3a和g）。PCR產(chǎn)物的Sanger測序結(jié)果證實(shí)了所有4個(gè)選定circRNA的反向剪接連接位點(diǎn)的存在（圖2d和h，附加文件3：圖S3b和h），與circBase一致。然后，我們使用不同的F2 / R2發(fā)散引物對每個(gè)circRNA進(jìn)行qPCR，其中F2穿過各自的circRNA連接位點(diǎn)。LUAD和LUSC組織中hsa_circ_ 0001821的上調(diào)和hsa_circ_0077837的下調(diào)首次在分析樣本中得到驗(yàn)證（圖2e和i），然后在獨(dú)立的患者樣本隊(duì)列中得到證實(shí)（圖2f和j）。同樣，已確認(rèn)hsa_circ_0001073和hsa_circ_0001495在NSCLC腫瘤中以亞型特異性模式異常表達(dá)，即hsa_circ_0001073僅在LUAD組織中被下調(diào)，而hsa_circ_ 0001495僅在LUSC組織中表現(xiàn)出較高的表達(dá)（其他文件3：圖S3c-f，il）。這些不同，circRNA的NSCLC亞型特異性失調(diào)表明了它們的亞型特異性生物學(xué)功能。

3、circRNA在NSCLC診斷中的潛在生物標(biāo)志物
   如圖3a和b所示，曲線下面積（AUC）可以將NSCLC與正常組織區(qū)分開，hsa_circ_0077837的曲線下面積為0.921（95％CI：0.868-0.975），而hsa_circ_0001821的曲線下面積為0.81（95％CI：0.797-0.929），暗示這兩種circRNA在NSCLC患者中具有較高的診斷潛力。另一方面，LUAD組織中hsa_circ_0001073的AUC為0.919（圖3c），LUSC組織中hsa_circ_0001495的AUC為0.965（圖3d），這意味著hsa_circ_0001073和hsa_circ_0001495已在NSCLC亞型中異常表達(dá)。這種特異性模式可以用作診斷生物標(biāo)志物，分別預(yù)測LUAD和LUSC。

總結(jié):
   在這項(xiàng)研究中，我們分析了NSCLC中circRNA的表達(dá)，包括LUAD和LUSC腫瘤及其鄰近的正常組織，發(fā)現(xiàn)LUAD和LUSC組織不僅具有共同的差異表達(dá)模式，而且還具有獨(dú)特的circRNA表達(dá)特征。此外，ROC分析表明，hsa_circ_0077837和hsa_circ_0001821對NSCLC非小細(xì)胞肺癌患者具有診斷潛力，而hsa_circ_ 0001073和hsa_circ_0001495可作為NSCLC非小細(xì)胞肺癌病理亞型的生物標(biāo)志物。