直腸癌是指從齒狀線至直腸乙狀結腸交界處之間的癌，是消化道最常見的惡性腫瘤之一。直腸癌位置低，容易被直腸指診及乙狀結腸鏡診斷。但因其位置深入盆腔，解剖關系復雜，手術不易徹底，術后復發率高。YAP活化是結直腸癌(CRC)等腫瘤發生發展的關鍵因素。然而，目前尚不清楚N6-Methyl腺苷(m6A)是否修飾了lon的轉錄本。 G非編碼RNA(LncRNAs)可調節YAP在腫瘤進展過程中的活化。2019年10月16日發表于 Mol. Cancer的一篇文章‘Long noncoding RNA GAS5 inhibits progression of colorectal cancer by interacting with and triggering YAP phosphorylation and degradation and is negatively regulated by the m6A reader YTHDF3’（影響因子： 10.679），主要研究了LncRNAs與m6A修飾在YAP信號傳遞和CRC進展中的功能聯系。
結果:
一、與YAP相互作用的lncRNA的篩選和鑒定
   在八種不同的CRC細胞系中分析GAS5表達與CRC細胞中的YAP表達呈負相關。當GAS5被抑制時，核YAP蛋白會積累，而當GAS5過表達時，核YAP蛋白會下降。與YAP相互作用的lncRNA的候選物數量，并發現GAS5與YAP直接相互作用并抑制YAP的核積累。

二、GAS5與YAP蛋白相互作用的生化特征
   GAS5突變體Δ3與YAP結合的效率與全長GAS5一樣有效，而其他突變體完全失去了其結合能力，表明與YAP結合需要GAS5的262-480位核苷酸。GAS5與YAP的171-263個氨基酸（aa）區結合（圖2j）該區域編碼稱為WW域的結構域，圖2k顯示了YAP GAS5結合復合物的結構。利用兩種獨立的方法，包括生物層干涉法（BLI）分析，RNA熒光原位雜交（RNA FISH）和免疫熒光共染色測定法，以鑒定lncRNA GAS5與YAP之間的相互作用。進行了BLI分析，以檢驗YAP–GAS5復合物與Fortebio Octet系統的結合親和力。生化映射表明，GAS5直接與YAP的WW域相互作用，以促進內源性YAP從細胞核到細胞質的轉運。                                                                            

三、GAS5促進YAP磷酸化，以促進其泛素化和降解
   GAS5-/-降低了絲氨酸127處的YAP磷酸化水平，上調了YAP目標基因CTGF的表達。由于GAS5的上調顯著抑制了YAP的總蛋白水平，而使YAP的mRNA水平保持不變，GAS5過表達細胞中多泛素化的YAP蛋白顯著增加。與全長GAS5一樣，GAS5突變體-Δ3的過度表達成功地促進了YAP磷酸化，而其他突變體則完全喪失了促進YAP磷酸化的能力（圖3f）。在YAP抑制和GAS5上調組中，針對差異表達基因的KEGG通路分析的相交分析表明，共有543個共同目標高度重疊，主要在同一方向和豐富了Hippo途徑，強烈支持GAS5在YAP信號傳導中的關鍵作用（圖3h-i）。GAS5通過促進YAP磷酸化和胞質螯合以促進其泛素化和降解來抑制YAP信號傳導。

四、LncRNA GAS5通過體內外YAP失調抑制大腸癌進展
   為了研究GAS5在CRC進展中的作用在體外和體內，進行構建穩定地過表達GAS5或與YAP共轉染的CRC細胞系。GAS5的過表達顯著抑制了CRC細胞的增殖和侵襲能力，而增加的YAP表達成功逆轉了GAS5介導的對CRC細胞增殖的抑制作用。體內實驗顯示GAS5的過度表達顯著損害了腫瘤的生長，同時伴隨著細胞活力和腫瘤體積的下降。說明GAS5通過在體外和體內抑制YAP信號傳導來抑制CRC進展。

五、YTHDF3是YAP的新型靶標，可在體外和體內受GAS5調控
   由于YAP的失調對CRC的病理生物學和進展具有重要意義，因此進行RNA干擾介導的YAP敲除，以發現CRC腫瘤進展的潛在新靶標。 YAP的過表達增加了YTHDF3的表達以及CTGF和CYR61的表達。 CRC細胞中，YAP和YTHDF3之間的mRNA和蛋白表達呈正相關（圖5g，h），YTHDF3是一個新穎的靶標YAP。YAP與YTHDF3的啟動子結合，YAP共轉染到CRC細胞中，YTHDF3啟動子的熒光素酶活性大大增強，而YAP特異性siRNA顯著抑制了熒光素酶活性（圖5j）。

   功能獲得和功能喪失分析表明，YTHDF3的敲低取消了YAP介導的CRC細胞增殖和侵襲的促進作用， GAS5的過表達抑制了YTHDF3和CTGF的表達，而YTHDF3的上調逆轉了GAS5介導的YTHDF3和CTGF的抑制作用。功能測定表明，GAS5的上調顯著抑制了CRC細胞的增殖和侵襲能力，而YTHDF3的共轉染逆轉了GAS5介導的CRC細胞增殖的抑制作用。腫瘤皮下生長和肺轉移異種移植小鼠模型表明，YTHDF3的過表達導致腫瘤生長速率和肺部定植能力的顯著加速，從而逆轉了由GAS5過表達導致的腫瘤抑制（圖6f和h）。表明YTHDF3是YAP的新靶標，而GAS5通過抑制YAPDF介導的YTHDF3在體內和體外的表達來抑制CRC細胞的增殖和侵襲。

六、YTHDF3結合m6A修飾的GAS5并促進GAS5的衰變
   由于在GAS5中積累了m6A修飾，YTHDF3敲低導致GAS5表達顯著增加，表明YTHDF3在m6A介導的GAS5降解中起主要作用。YTHDF3選擇性結合m6A修飾的GAS5并以甲基化依賴性方式調節GAS5降解，為CRC進展中GAS5失調提供了基礎。

七、CRC患者腫瘤中LncRNA GAS5表達與YAP和YTHDF3蛋白水平呈負相關
   與鄰近組織相比，CRC組織中GAS5的表達降低，而GAS5較低的表達與CRC患者腫瘤組織中YAP和YTHDF3的表達升高有關。后發現YTHDF3的高表達是CRC患者總體生存不良的重要預后因素，為CRC治療提供了一種有希望的方法。

結論:
   lncRNAs和CRC中YAP信號的m6A修飾之間的功能聯系。LncRNA GAS5直接與YAP結合，促進其磷酸化和泛素介導的降解，從而減弱YTHDF3的YAP介導轉錄，后者可逆、選擇性地與m6A甲基化的GAS5結合，觸發其衰變，形成負反饋環。該實驗提出了lncRNA GAS5-YAP-YTHDF3軸在CRC進展中的負功能環，這可能為CRC的治療提供一種有前景的方法。