導語:
 炎性細胞活化在肝病期間驅動多種細胞程序設計。低氧誘導因子（HIFs）最近已被確定為免疫和炎癥的重要調節劑。在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）中，HIF-1α在肝細胞中被上調，并誘導脂肪變性。然而，尚未探討HIF-1α在代謝應激下巨噬細胞中的作用。
技術路線:
1、對比甲硫氨酸缺乏膽堿（MCD）飲食喂養的小鼠和NASH患者的巨噬細胞肝巨噬細胞中的HIF-1α的水平。
2、驗證HIF-1α的增加與小鼠和人類巨噬細胞中自噬標記物BNIP3，Beclin-1，LC3-II和p62之間的關聯。
3、證明在巨噬細胞中穩定的HIF-1α水平的LysMCre-HIFdPAfl / fl小鼠與采用MCD飲食的HIFdPAfl / fl小鼠相比較脂肪變性和肝臟炎癥情況。
4、利用體外和離體實驗表明飽和脂肪酸棕櫚酸（PA）誘導HIF-1α并損害巨噬細胞的自噬通量。
5、使用siRNA介導的敲低和HIF-1α在巨噬細胞中的過度表達，證明PA通過HIF-1α損害自噬。
研究結果:
1、肝巨噬細胞增加了NASH中的HIF-1α表達并損害了自噬通量。
   使用了MCD飲食誘導的NASH小鼠模型，以油-紅-O染色和明顯的壞死性炎癥指示的脂肪變性顯示。MCD飲食誘導的NASH的總肝臟HIF-1αmRNA水平顯著增加（5倍），并且分離的肝單核細胞（LMNCs升高6倍）。飼喂HF-HC-HS飲食的小鼠表現出與MCD飲食模型相似的肝臟和LMNC中HIF-1α升高的趨勢。檢測到MCD飲食喂養的小鼠中HIF-1α蛋白水平顯著增加，并且發現自噬標志物，BNIP3，Beclin-1，LC3-II和p62的表達與MCS對照相伴增加。與MCS對照相比，MCD飲食喂養的小鼠肝臟中F4 / 80染色證實了巨噬細胞浸潤的增加。與對照組相比，NASH肝巨噬細胞中HIF-1α和自噬標志物Beclin-1，LC3-II，BNIP3和p62的含量均顯著更高（圖2B）。結果表明NASH中的巨噬細胞調節涉及增加HIF-1α表達和減少自噬通量。

2、NASH患者的肝巨噬細胞和循環單核細胞顯示HIF-1α表達增加且自噬通量受損。
   在NASH患者的肝臟中，與健康對照組相比，我們檢測到F4 / 80 +巨噬細胞的數量顯著增加，這與在MCD飲食喂養小鼠的肝臟中的發現一致。 接下來，比較了NASH患者和健康對照組的循環單核細胞中HIF-1α的表達和自噬標記，發現NASH患者的HIF-1α和LC3-II蛋白水平升高，但BNIP3，Beclin-1和p62水平沒有差異。 因此，結果表明NASH患者外周血單核細胞的自噬通量受損。

3、穩定髓樣細胞中的HIF-1α可增強MCD飲食誘導的炎癥和脂肪變性。
   使用了LysMCreHIFdPAfl / fl小鼠，其中髓樣細胞中HIF-1α的水平穩定，導致HIF-1α的水平高于野生型小鼠。使用PCR證實了LysMCreHIFdPAfl / fl小鼠和相應的對照小鼠HIFdPAfl / fl的基因型。BMDM和肝巨噬細胞中HIF-1αmRNA水平增加，但肝細胞中HIF-1αmRNA水平沒有增加，這證實了HIF-1α的髓樣細胞特異性增加。在來自LysMCreHIFdPAfl / fl小鼠的BMDM中，BNIP3和p62 mRNA水平以及LC3-II蛋白水平均升高。然而，p62蛋白水平并未顯著增加。與HIFdPAfl / fl小鼠相比，LysMCreHIFdPAfl / fl的肝巨噬細胞中MCP-1，IL-1β和IL-10的mRNA水平增加。與HIFdPAfl / fl小鼠相比，接受MCD飲食5周后，LysMCreHIFdPAfl / fl小鼠表現出更大程度的肝脂肪變性和ALT水平。 MCP-1，TNF-α和PAI-1 mRNA水平的升高表明脂肪變性和肝損傷的增加以及肝臟炎癥的發生。總之，這些結果表明，巨噬細胞HIF-1α水平的增加通過自噬通量的受損和促炎性細胞因子的增加而促進了MCD飲食誘導的NASH。

4、棕櫚酸激活HIF-1α并削弱巨噬細胞自噬通量。
   PA治療原發性肝和骨髓源性巨噬細胞（BMDM）增加HIF-1αmRNA水平，然后上調HIF-1α靶基因BNIP3和PAI-1。BMDM中的HIF-1α蛋白水平也有所提高和PA處理后人類巨噬細胞與p62和LC3-II水平的升高相關。巴氟霉素與PA的組合不會進一步增加LC3-II的水平。將LC3-II對β-肌動蛋白的條帶強度歸一化，并計算了經bafilomycin處理與未處理的人類巨噬細胞的歸一化LC3-II條帶比率。人類THP-1巨噬細胞中的PA處理誘導HIF-1αmRNA水平迅速升高，并在3小時達到峰值，然后上調HIF-1α靶基因，BNIP3，PAI-1和Glut-1、12刺激后-24小時。HIF-1α蛋白水平和DNA結合PA處理后，人THP-1巨噬細胞中的活性也增加了。我們發現PA治療可導致BNIP3，Beclin-1，LC3-II和p62水平顯著增加巨噬細胞。使用熒光顯微鏡，證明了PA刺激后，具有LC3-II點狀細胞的百分比顯著增加，這是自噬的一種表現。bafilomycin加PA的組合并沒有進一步增加LC3-II的水平。這表明自噬通量的減少以bafilomycin引起的LC3-II或p62誘導降低為代表。

5、HIF-1α調節PA刺激的巨噬細胞的自噬。
   為了測試HIF-1α是否在PA誘導的代謝應激下調節巨噬細胞的自噬，檢查了其中siRNA敲低HIF-1α的巨噬細胞或通過質粒轉染增強了HIF-1α的巨噬細胞。使HIF-1α沉默可防止PA誘導的HIF-1α增加，并顯著下調BNIP3，Beclin-1和LC3-II表達。 HIF-1α的過表達顯著增加了PA誘導的HIF-1α和自噬成分BNIP3，Beclin-1和LC3-II的水平。PA刺激后，HIF-1α誘導在6-12小時達到峰值，BNIP3，Beclin-1和LC3-II在6-24小時左右達到峰值。在巴氟霉素處理的THP-1巨噬細胞中，PA在HIF-1α敲低細胞中增加了LC3-II的誘導，但在對照細胞中則沒有。 HIF-1α過表達產生相反的效果；與對照細胞相比，PA降低了過表達HIF-1α的經巴菲霉素處理的巨噬細胞的LC3-II誘導。

6、HIF-1α介導的巨噬細胞自噬抑制棕櫚酸誘導的促炎反應并下調NF-κB活化。
   PA處理后，THP-1巨噬細胞中NF-κB的DNA結合活性和促炎細胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6的水平呈時間依賴性增加。在HIF-1α敲低的細胞中，PA誘導的p65磷酸化被完全消除，在來自LysMCreHIFdPAfl / fl小鼠的肝巨噬細胞中觀察到了類似的效果，顯示出增強的MCP-1和IL-1β。單獨使用3-MA抑制巨噬細胞的自噬會增加NF-κB的激活，而使用3-MA加PA的治療會進一步增強這種激活。當我們沉默負責自噬體形成的蛋白質ATG5時，我們發現未處理的細胞和用PA處理的細胞中LC3-II表達和p65磷酸化均降低。Bafilomycin治療未能調節培養基或PA刺激的巨噬細胞中的p65磷酸化，表明自噬功能受損不會影響巨噬細胞中NF-κB的活化。用3-MA抑制自噬沒有明顯的附加作用。結果表明，HIF-1α參與了NF-κB的激活，巨噬細胞的促炎反應以及PA誘導的自噬的損害。

總結：
   棕櫚酸通過巨噬細胞中的HIF-1α激活來損害自噬。 HIF-1α和受損的自噬存在于NASH體內的小鼠巨噬細胞和人血單核細胞中。從而發現，HIF-1α激活和自噬通量減少通過上調NF-κB激活刺激巨噬細胞中的炎癥。這些結果表明，NASH中的巨噬細胞活化涉及HIF-1α和自噬之間的復雜相互作用，因為這些途徑促進MCD飲食誘導的NASH中的促炎性過度活化。
   這篇研究表明巨噬細胞特異性HIF-1α在NASH小鼠模型中的作用。盡管MCD飲食喂養的小鼠會出現脂質蓄積，肝炎癥和纖維化，但它們并未表現出體重增加或胰島素抵抗，這在人類NASH患者中觀察到。但是，我們發現NASH患者的人類血液單核細胞以及HF-HC-HS飲食的小鼠的肝臟和LMNC中的HIF-1α表達均增加，這可能暗示在HIF-1α表達增加后觀察到的效應也可能存在于類人模型中。總之，在NASH中，PA對巨噬細胞中HIF-1α的激活在疾病進展中具有重要作用。巨噬細胞中的HIF-1α激活降低自噬通量并增加IL-1β的產生。 HIF-1α還激活NF-κB，這對于MCP-1表達很重要。 IL-1β和MCP-1均可引起肝脂肪變性和炎癥。文章指出了巨噬細胞特異性HIF-1α在MCD飲食誘導的NASH中的重要作用。鑒于晚期NASH中普遍存在炎癥，因此未來的工作應評估HIF-1α活化的巨噬細胞特異性靶向是否具有潛在的治療應用。