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lncRNA通過ceRNA機制靶向Mir26a調節自噬促進心肌損傷

欄目:最新研究動態 發布時間:2020-02-11
ncRNA在多種生物學過程中充當調控因子的作用,但是他在急性心肌梗塞(AMI)中的作用尚不清楚......

lncRNA通過ceRNA機制靶向Mir26a調節自噬促進心肌損傷

lncRNA在多種生物學過程中充當調控因子的作用,但是他在急性心肌梗塞(AMI)中的作用尚不清楚。今年九月剛發表在影響因子11.059Autophagy雜志上的一篇文章探索了這一過程,并發現了lncRNA 2810403D21Rik/Mirf通過靶向Mir26aceRNA機制作為抗自噬分子發揮作用。

 

實驗結果如下:

1、Mir26a在心肌梗死中的心臟保護作用:自噬的作用

在心肌梗塞(MI)的小鼠模型中Mir26a表達下調(圖1A);類似的,使用雙氧水處理后的小鼠Mir26a表達也下調(圖1B);沉默表達Mir26a降低了自噬體和自噬溶酶體的數量(圖1C);并且LC3-II的表達下降,而SQSTM1/p62的表達升高(圖1 D)。作者構建了Mir26a海綿轉基因小鼠模型,顯著降低小鼠內源性Mir26a的表達(圖1E),并降低了射血分數和分數縮短 (Figure 1F),這表明Mir26a敲除損傷了小鼠的左心室功能。此外,Mir26a敲除阻礙了自噬體形成導致心臟中自噬反應下降(圖1G)。

1敲低Mir26a會減少自噬而損害心臟功能

 

另一方面,Mir26a的過表達減輕了雙氧水對新生小鼠心肌細胞(NMCMs)的細胞活力的抑制作用,這種抑制作用被自噬拮抗劑3-MA所消除(圖2 A);過表達Mir26a促進了自噬體的形成以及自噬體-溶酶體的融合,但3-MA可抑制這個作業(圖2B);過表達Mir26a可改善心肌梗死模型小鼠的心臟功能,縮小梗死面積(圖2CD);透射電鏡觀察到Mir26a對心肌梗死小鼠自噬的促進作用(2 E)WB顯示,過表達Mir26a可以促進MI小鼠自噬相關蛋白的表達(2F)

 

2 Mir26a的強制表達通過激活自噬保護心肌細胞免受損傷

 

2Mir26a心臟保護作用的信號機制:Usp15的鎮壓

Targetscan預測分析發現編碼Usp15的基因包含了Mir26a的種子序列,該基因在人類、小鼠和大鼠中具有廣泛的保守性(圖3A);有報道稱Usp15拮抗患者成纖維細胞的線粒體吞噬作用,但作者發現在MI心臟的邊緣區域和暴露于雙眼水的心肌細胞中Usp15上調表達(圖3BC)。共轉染Mir26a后,只有攜帶WT Usp15結合位點的熒光素酶載體或結合位點1突變的熒光素酶載體(mut-1)表現出熒光素酶活性抑制 (3D)Mir26a降低了USP15蛋白的水平,但AMO-26a卻提高了USP15蛋白的水平,盡管它們均未影響Usp15的轉錄(圖3EF)。Mir26a KD小鼠中USP15的表達增加(圖3G)。在NMCM中過表達Mir26a抑制了SQSTM1 / p62的表達,并促進了LC3-II,ATG7ECN1 / Beclin1ATG5的表達(圖3H)。

3 Usp15Mir26a的直接靶標

4、LncRNA 2810403D21Rik/Mirf能夠結合并調控Mir26a的活性

使用miRanda數據庫預測到候選的lncRNA AK007586,qRT-PCR顯示它在MI模型小鼠中顯著上調,將其命名為2810403D21Rik/Mirf,定位于細胞質(圖4AC);在雙氧水刺進的NMCM2810403D21Rik/Mirf的表達顯著上調(圖4B);過表達2810403D21Rik/Mirf抑制Mir26a的表達,沉默則相反(圖4DE);熒光素酶實驗得出類似的結論(圖4F-I);親和分離實驗表明,2810403D21Rik/MirfAGO2相互作用(4J)。心肌細胞用生物素化的Mir26a轉染,然后以生物素為基礎做親和力分離試驗,其中通過qRT-PCR(圖4L)和瓊脂糖凝膠電泳(圖4M)表明Mir26a可以拉下2810403D21Rik / Mirf,并且Mir26a2810403D21Rik / Mirf的識別是序列特異性的。這些結果表明2810403D21Rik / MirfMir26aAGO2直接相互作用形成RISC并調節Mir26a的表達和活性。

4 LncRNA 2810403D21Rik/Mirf調控Mir26a的表達和活性

 

5LncRNA 2810403D21Rik/Mirf通過Mir26a-Usp15軸調節自噬

2810403D21Rik/Mirf限制了Mir26a/Usp15軸的功能,從而抑制自噬,通過減輕內在的心臟保護活性而導致心肌損傷

5 2810403D21Rik/Mirf通過調節Mir26aUsp15調節自噬,促進NMCMs的心臟損傷

 

如圖6所示, 2810403D21Rik/Mirf沉默通過激活Mir26a和自噬保護雙氧水誘導的心肌損傷。

6抑制2810403D21Rik / Mirf可以通過增加Mir26a的自噬調節來拮抗NMCM中雙氧水誘導的損傷。

 

如圖7所示,f-2810403D21Rik/Mirf可以模擬2810403D21Rik/Mirf對自噬和細胞損傷的作用,說明Mir26a結合位點是2810403D21Rik/Mirf的功能域。

 

7 f-2810403D21Rik/Mirf的過表達通過抑制內源性Mir26a在體外培養的心肌細胞中引起心肌損傷

 

6、沉默2810403D21Rik/Mirf可以減輕心肌損傷,保護心肌梗死小鼠的心臟功能

如圖8所示,2810403D21Rik/Mirf的沉默可調節自噬,對缺血性心功能損害具有保護作用。

8 MI小鼠模型中沉默2810403D21Rik / Mirf可減輕心肌損傷并保護心臟功能

 

簡而言之,本文鑒定了一種新型的抗自噬lncRNA 2810403D21Rik / Mirf,它通過ceRNA機制來調節Mir26a的水平,從而加劇了缺血性心臟損傷。因此,調節2810403D21Rik / Mirf的表達可能是預防和治療AMI的新方法。