N6-甲基腺苷（m6A）修飾是真核mRNA中最常見的化學修飾之一，對mRNA的穩定性，剪接和翻譯產生重要影響。最近，人們越來越認識到m6A在腫瘤發生中的調節作用。然而，m6A的失調及其在腫瘤上皮-間質轉化（EMT）和轉移中的功能仍然不清楚。該研究采用qRT-PCR和免疫組織化學方法檢測胃癌（GC）中METTL3的表達。通過體外和體內試驗研究了METTL3對GC轉移的影響。通過轉錄組測序，m6A測序，m6A甲基化RNA免疫定量逆轉錄聚合酶鏈反應（MeRIP qRT-PCR），共聚焦免疫熒光測定，熒光素酶報告基因測定，共免疫沉淀，RNA免疫沉淀和染色質免疫沉淀測定等方法探索了METTL3的作用機理。

結果：
一、METTL3過表達及其在GC中的預后價值
   通過臨床數據集TCGA（癌癥基因組圖譜）和GSE66229，發現GC組織中METTL3 mRNA表達顯著升高，胃癌組織中METTL14表達降低，且兩個數據集中的其他m6A“writers” 和 “erasers”水平不一致（圖1a，b）。qRT-PCR驗證了由60對GC組織中METTL3的mRNA水平明顯過表達（圖1c），METTL3在晚期（III-IV）的GC組織中明顯更高（圖1d），GC組織中觀察到m6A mRNA的水平升高（圖1e）。免疫組化檢查了120例的GC組織微陣列樣品中METTL3的蛋白水平。METTL3顯著地定位在GC細胞核中(圖1f)。Kaplan-Meier曲線顯示，具有METTL3高表達的患者表現出較差的總生存期（OS）和無病生存期（DFS）（圖1g，h）。總之，METTL3在GC中明顯過表達，可能與GC進展有關。

二、EMT需要METTL3
   免疫組化連續切片染色顯示GC組織中METTL3的表達水平似乎與E-鈣粘蛋白負相關，而與N-鈣粘蛋白和波形蛋白正相關（圖2a）。MKN-28細胞系顯示E-鈣粘蛋白的高表達，而N-鈣粘蛋白和波形蛋白的水平低，這是其上皮表型的代表（圖2b）。為驗證EMT程序是否需要METTL3，進行了功能喪失和功能獲得研究（圖2c，d）。敲低METTL3會導致N-鈣粘蛋白和波形蛋白的顯著下調，同時在BGC823和AGS細胞中蛋白質水平上E-鈣粘蛋白的顯著上調。METTL3的過表達在MKN-28細胞中引起相反的結果（圖2e），METTL3的敲低或過表達分別也降低或增加了GC細胞中總體m6A修飾水平（圖2f，g）。總之，METTL3促進了GC細胞中的EMT程序。

三、METTL 3促進胃癌細胞在體內外的侵襲和轉移
   通過傷口愈合實驗顯示METTL 3表達的減弱明顯抑制了BGC 823細胞的遷移能力(圖3a)，METTL 3的強制表達明顯增加了MKN-28細胞的遷移速度(圖3b)。Transwell侵襲實驗證實，敲除METTL 3基因后，GC細胞的侵襲能力受到明顯抑制(圖 3C)，而METTL 3的異位表達則顯著地增強了它的表達(圖3d)。研究發現BGC 823-shRNA細胞轉移到裸鼠肺部的效果不如對照組(圖3e，f)。METTL 3的過表達明顯增加了MKN-28細胞的肺轉移負擔(圖3g，h)。小鼠原位模型實驗，在裸鼠胃漿膜下注射穩定的MKN-28細胞，GC細胞植入后5周觀察腫瘤浸潤肌層和粘膜發現METTL 3高表達組的腫瘤比對照組大。此外，METTL 3過表達組可觀察到肝轉移灶，但不在對照中（圖3i-k）。表明METTL3在促進GC細胞侵襲和轉移中起著至關重要的作用。

四、轉錄組-測序和m6A-測序鑒定ZMYM 1是METTL 3的直接靶點
   通過轉錄組測序比較在BGC 823細胞中敲除METTL 3后的基因表達譜，結果發現798個基因被顯著下調，662個基因被顯著上調(圖4a，b)。通過m6A測序鑒定了9465和8794 m6A峰對照和METTL3-缺陷細胞（圖4c)。在BGC823細胞中，METTL3穩定敲低，發現850個峰減少(圖4d)。在BGC 823細胞中映射m6A甲基體時，在免疫純化的RNA中，m6A共識序列GGAC（R RACH）基序在m6A位點中高度富集（圖4e）。與以前的研究一致，我們證明了m6A信號。 L在mRNAs的終止密碼子附近富集(圖4f)。用798個下調的基因過濾掉850個減少的m6A峰，從而鑒定出由13個基因帶來的15個峰（圖4g）。在這13個潛在的調節因子中，我們的重點是ZMYM1，因為在sh-NC BGC823細胞中在其mRNA的終止密碼子附近檢測到兩個m6A峰，并且在METTL3敲低后均被減弱（圖4h）。ZMYM 1的生物學功能尚不清楚，因此選擇了ZMYM1作為METTL 3介導的m6A修飾的候選靶點。

五、METTL 3在GC中維持ZMYM 11的表達
   與基因表達數據一致，分別在mRNA和蛋白水平上ZMYM1的表達被下調或上調的METTL3的敲低或過表達(圖5a-d)。免疫熒光染色顯示ZMYM 1的核定位及METTL3的缺失誘導BGC 823細胞ZMYM 1的表達損失，而過表達METTL 3則增加MKN-28細胞的ZMYM 1水平(圖5e)。qRT-PCR驗證了隊列1中ZMYM1的表達。 在這個樣本人群中，ZMYM1表達經常在GC組織中升高，并與METTL3表達正相關（圖5f，g）。 通過共聚焦成像也證實了METTL3和ZMYM1在GC組織中的核共定位（圖5h）。數據表明，METTL 3正調控ZMYM 1在GC中的表達。

六、METTL 3通過m6A-Hur依賴途徑增強ZMYM 1 mRNA表達
   MERIP、qRT-PCR對m6A測序數據集進行了驗證，結果抗m6A抗體顯著富集胃癌細胞中ZMYM1 mRNA水平的變化。METTL 3的敲除或過表達顯著降低或增加了ZMYM1 mRNA的m6A水平(圖6a，b)。突變體ZMYM 1的m6A修飾因m6A一致序列(RACH)中的胞嘧啶取代腺苷堿而被取消(圖6c)。熒光素酶報告試驗表明，野生型ZMYM 1的轉錄水平不高，突變體在沒有METTL 3的情況下顯著降低(圖6d)。METTL 3過表達增強了野生型ZMYM 1融合報告基因的表達，顯示ZMYM 1水平的調控受METTL 3相關m6A修飾的控制(圖6e)。HuR結合位點位于ZMYM1的m6A修飾區域，這是由我們的m6A測序所揭示的（圖4f）。使用抗HuR抗體的RIP-qPCR顯示，在METTL3沉默的BGC823細胞中，HuR對ZMYM1 mRNA的親和力大大降低，而在MKN-28細胞中，METTL3的過表達則顯示出相反的結果（圖6f，g）。經修飾的METTL 3表達后，所有GC細胞的Hur表達情況均無明顯變化(圖6~j)。揭示了METTL 3介導的m6A修飾通過m6A-Hur依賴性途徑增強ZMYM 1的表達。

七、ZMYM 1與核內的CtBP/LSD 1/COREST復合物有物理聯系
   鋅指家族蛋白參與了轉錄調控。我們將全長ZMYM 1融合到gal 4的DNA結合區，并測試了其在GC細胞中的轉錄活性。結果表明，標記ZMYM1在BGC823和MKN-28細胞中均以劑量依賴性方式顯著抑制報告基因的活性(圖7a，b)。ZMYM1的過表達根本不影響Gal4驅動的報道分子的活性（圖7c），這表明ZMYM1與DNA物理結合，發揮其轉錄抑制活性。IP用抗ZMYM1的抗體進行IP免疫，然后用抗CtBP / LSD1 / CoREST復合物成分的抗體進行免疫印跡，證明ZMYM1與所有測試的蛋白質都有相互作用（圖7d，e）。相反，用抗CtBP1 / 2，LSD1或CoR EST抗體進行IP免疫接種，然后用抗ZMYM1抗體進行免疫印跡也證實ZMYM1被該復合物的所有組分有效地免疫共沉淀（圖7f）。結果表明ZMYM1在物理上與CtBP / LSD1 / CoREST復合體相關。

八、ZMYM 1相關復合物對E-鈣粘素的轉錄抑制作用
   實驗中，對CRS上所有復雜組分的富集進行了驗證（圖7g)。此外，ZMYM1、CTBP1、LSD1和COREST的共同占有 在E-cadherin啟動子上，通過重新芯片分析(圖7H)確定了E-cadherin啟動子。為了進一步證實ZMYM 1相關復合物對E-cadherin的轉錄抑制作用，我們進行了WB分析。 裂解并發現ZMYM1的增益-功能伴隨E-cadherin的降低表達。顯著地，在CTB中，ZMYM1過表達引起的E-cadherin的衰減被取消。 P1，LSD 1，或支柱被擊倒(圖7i)。數據表明，ZMYM 1通過與CtBP/LSD 1/Corest復合物結合，靶向和抑制E-cadherin的轉錄。

九、METTL 3介導的ZMYM 1表觀遺傳激活與胃癌的EMT和轉移有關
   在MYTTL3敲低細胞中，ZMYM1表達的升高概括了N鈣粘蛋白和波形蛋白的水平，并降低了E鈣粘蛋白的表達(圖8a)。相反，抑制ZMYM1至少部分抵消了METTL3過表達引起的EMT進程加速（圖8b）。 Transwell入侵試驗表明，敲低METTL3降低了GC細胞的侵襲能力，而ZMYM1的異位表達挽救了這種能力（圖8c，e）。相反，過表達METTL3可增強細胞侵襲能力，與sh-ZMYM1質粒共轉染可部分減弱細胞侵襲能力（圖8d，f）。對于肺轉移模型，觀察到相似的結果。引入ZMYM1可以至少部分抵消METTL3敲低對轉移的抑制作用，而與METTL3過表達相關的轉移潛能的增加則可以通過ZMYM1的耗盡而部分減弱（圖8g，h）。此外，根據免疫組織化學結果，ZMYM1的蛋白水平隨著肺轉移負擔的減少而降低，并因修飾的METTL3表達引起的更多的肺定植而被上調（圖8i，j）。表明ZMYM1的過表達與METTL3介導的EMT和轉移有關。

結論：
   m6A修飾在GC中的關鍵作用，并發現METTL3 / ZMYM1 / E-鈣粘蛋白信號傳導是針對GC的抗轉移策略的潛在治療靶標。