外泌體是細胞分泌的30-100nm的脂質雙層膜結構的囊泡,內含蛋白質、核酸、脂質等成分，也是體液中的重要信息物質。越來越多的研究揭示了外泌體在細胞間通訊中的作用，同時也對外泌體作為疾病診斷和治療的分子標志物進行了探索。但其中仍存在的一個重要問題是如何對體液中復雜的外泌體組成進行精準的分析和分類，并從占比極小的疾病相關外泌體中獲取更準確的信息。此前，在nature biotechnology雜志上發表了稱為nano-plasmonic exosome (nPLEX) assay對該問題進行了探索[1]。
   在Nature communication雜志最新一期中，研究人員針對這一問題從另一個角度開發了proximity-dependent barcoding assay (PBA)方法。讓我們一起了解一下吧。

   該方法希望通過各種外泌體表面蛋白的差異，分析各種外泌體的含量、該方法流程圖如圖一所示。首先篩選得到針對各種外泌體表面蛋白的高親和力、特異性抗體。然后使用一段特定的寡核苷酸與抗體偶連。在該段序列上，含有標記特定抗體（蛋白）的protein Tag序列，即最終測序結果中該序列代表某個外泌體表面含有該蛋白質。此外，在protein Tag序列后含有隨機的8-nt random unique molecular identifier (UMI)序列，稱為molecule Tag。該序列用來區分PCR擴增后的每一個特定蛋白質分子[2]。該復合物被稱為PBA probes。與此同時，作者設計了含有標記單個外泌體的complex Tag的環狀DNA分子，并通過適當的Roling circle amplification（RCA）獲得約幾百拷貝的RCA產物。即特定complex Tag序列代表某個外泌體。

                                 圖1 proximity-dependent barcoding assay (PBA)方法流程圖
   待分析的外泌體孵育后與PBA probes后，接種在特定的96孔微量滴定板上。在該捕獲設備上，已經以設計好的稀疏的密度偶連了cholera toxin subunit B (CTB)；該蛋白可以結合外泌體膜上的GM1 gangliosides從而捕獲外泌體。接下來，將RCA產物加入體系中并使其通過互補序列與probes結合。最后通過PCR擴增和建庫測序便可讀取所有的外泌體上檢測蛋白的含量。
 
   對這一新開發的實驗方法，作者首先檢測了它的檢測準確度。通過鏈霉素生物學系統模擬檢測實驗，作者使用了四種protein Tag進行了測試。在分開孵育和混合孵育后作者檢測了四種protein Tag極其molecule Tag的比例。檢測結果與理論相符。protein Tag檢測比例與混合比例一致。Molecule Tag數也與理論比例一致。飽和情況下，鏈霉素與生物素結合比例為1：4。

                                          圖2 鏈霉素模擬實驗檢測PBA準確性
 
  在采用模擬實驗檢測該方法后，作者使用外泌體標志蛋白CD9和CD63抗體對該方法進行了進一步驗證。在tag A-C和tag B-D分別孵育時，只能檢測到同時含A-C和B-D的蛋白標記。當四種tag標記的抗體同時孵育時，則各種tag組合均能檢測到。這說明該方法在檢測外泌體時同樣適用。

                                           圖3 CD9和CD63檢測驗證PBA準確性
 
   接下來作者使用了該方法對復雜的混合外泌體進行了研究。作者共檢測了16中細胞系上清外泌體和2中體液外泌體的混合體系中的38個已報道的外泌體蛋白含量。圖4a中熱圖展示了各個蛋白的含量分布。在使用3個或三個以上的蛋白分子數數據進行降維分析后，作者發現這些蛋白含量差異能在一定程度上區分不同來源的外泌體。

                                    圖4 PBA分析18種外泌體混合體系中38個蛋白質的含量差異

   最后，作者比較了混合樣品中K562細胞、前列腺小體、健康者血清中外泌體蛋白的差異。在圖5a中，作者展示了鑒定的主要在K652或前列腺小體外泌體中存在的蛋白質組合。

                               圖 5 K562和前列腺小體外泌體對比健康血清中外泌體的特異蛋白質組合分析
小結：
   雖然該方法仍存在著一些限制。比如對抗體親和力、特異性要求高；測序深度要求很大等。但對檢測高異質性的外泌體中特定組分的變化和更有效的對疾病進行早期診斷提供了很好的技術手段。
參考文獻：
1.Im, H., et al., Label-free detection and molecular profiling of exosomes with a nano-plasmonic sensor. Nat Biotechnol, 2014. 32(5): p. 490-5.
2. Kivioja, T., et al., Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers. Nat Methods, 2011. 9(1): p. 72-4.