肝細胞癌（HCC）是全球排名第三的死亡相關癌癥，HCC的臨床特征是其侵襲性，預后不良和治療機會有限。近期, 復旦大學中山醫院研究團隊在Molecular Cancer期刊上發表了一題名為：Circular RNA circTRIM33–12 acts as the sponge of MicroRNA-191 to suppress hepatocellular carcinoma progression的文章。該文章主要講述了circTRIM33-12可以作為致癌miR-191的吸附海綿起作用以上調TET1表達并因此抑制HCC進展。

一、在HCC中調節TRIM33衍生的circTRIM33-12
   TRIM33是一種腫瘤抑制基因，TRIM33在HCC中的下調是由TRIM33啟動子中CpG島的高度甲基化引起的，表明源自TRIM33的circRNA表達可能在HCC細胞中下調。作者通過qRT-PCR分析了四對HCC組織樣品中18種TRIM33來源的circRNA。在四個HCC腫瘤組織中的circTRIM33-12（hsa_circRNA8662-12）表達顯著降低。circTRIM33-12由TRIM33外顯子12-18組裝而成。為了進一步研究circTRIM33-12表達對HCC患者的預后意義，對200例HCC及癌旁組織進行qRT-PCR驗證circTRIM33-12的表達。與癌旁組織相比，116例（58%）HCC組織中circTRIM33-12表達顯著降低。以circTRIM33-12的表達中間值為節點，對HCC組織進行高表達與低表達劃分。分析circTRIM33-12表達與HCC患者臨床病理特征之間的關系，與高表達的患者相比，cirTRIM33-12 表達量低的 HCC患者腫瘤大小較大（P ?= 0.022），腫瘤數量多（P ?= 0.028），侵襲強（P ?= 0.007）。對這200例患者進行術后生存和術后復發進行分析，發現cirTRIM33-12低表達患者生存期顯著高于高表達患者，手術復發顯著低于高表達患者。

二、circTRIM33-12抑制HCC細胞的增殖和侵襲
   從7種HCC細胞系中篩選circTRIM33-12低表達細胞系，選取SMMC-7721和HCCLM3進行后續試驗。與對照組相比，過表達circTRIM33-12后SMMC-7721和HCCLM3細胞的生長和轉移顯著受到抑制。敲低circTRIM33-12促進了高表達細胞系Huh 7和MHCC97L細胞的生長和轉移。為了進一步探索circTRIM33-12在體內的作用，將過表達的SMMC-7721和對照組種植到小鼠肝內。過表達的腫瘤體積和轉移能力顯著低于對照組。

三、circTRIM33-12可作為miR-191的吸附海綿
   Huh 7細胞中用針對AGO2的抗體進行RIP實驗，circTRIM33-12對AGO2抗體有明顯富集作用，表明可作為AGO2和miRNA的結合平臺。使用數據庫預測到11個可能與circTRIM33-12結合的潛在miRNA。這11種miRNA中有三種是癌基因，分別是miR-23a-3p，miR-191和miR-224-5p。為了進一步研究circTRIM33-12與這三種miRNA結合，構建含有熒光素酶基因的circTRIM33-12表達質粒載體，并將質粒載體轉染到Huh 7細胞中。觀察到轉染后3種miRNA減少，特別的miR-191顯著減少。使用生物素標記的miR-191進行pulldown實驗，與NC組相比miR-191對circTRIM33-12有明顯富集作用。對miR-191敲低過表達，發現circTRIM33-12表達沒有變化；circTRIM33-12過表達后，miR-191表達也沒有變化。這說明circTRIM33-12和miR-191可能不會相互降解。這些實驗表明，circTRIM33-12可以作為miR-191的吸附海綿起作用。

四、circTRIM33-12通過海綿miR-191上調TET1表達
   一些研究顯示，TET1，TIMP3，SATB1和DIECR1受miR-191影響。但是在炎癥細胞系中上調或敲低miR-191對它們的mRNA和蛋白表達水平沒有改變，但是對TET1蛋白表達有影響。使用熒光素酶報告法檢測TET1 mRNA的3'UTR是否是HCC細胞中miR-191的靶標，結果表明miR-191和TET1 mRNA在HCC細胞中的直接相互作用。為了驗證circTRIM33-12對TET1表達的影響，過表達circTRIM33-12，檢測TET1 mRNA和蛋白質表達水平。結果表明，circTRIM33-12的過表達顯著增加TET1蛋白水平而不是mRNA水平。circTRIM33-12的敲低顯著降低TET1蛋白水平而不是mRNA水平。熒光素酶活性測定表明敲低circTRIM33-12后，TET1活性下降；circTRIM33-12與miR-191一起敲低后，TET1活性無影響。circTRIM33-12過表達后，TET1活性增強；circTRIM33-12過表達同時miR-191敲低后，TET1活性無影響。在200例HCC患者組織使用qRT-PCR和IHC驗證TET1的表達。發現在HCC患者中circTRIM33-12和TET1之間呈正相關關系。

五、circTRIM33-12和TET1負責調節5hmC的表達
   在circTRIM33-12和TET1過表達的SMMC-7721和HCCLM3細胞中比較5mC和5hmC水平，發現在circTRIM33-12-或TET1-過表達細胞中5hmC的水平顯著增加；相反，，在circTRIM33-12或TET1敲低的Huh 7和MHCC97L細胞中5hmC的水平顯著降低。并且過表達TET1的細胞細胞增殖和侵襲遷移能力明顯減弱。結果與第二部分完全結果一致，。這些數據證明了circTRIM33-12作為miR-191的吸附海綿抑制HCC進展，通過circTRIM33-12 / miR-191 / TET1軸抑制miR-191致癌作用。

六、TET1負調節癌基因表達并與免疫逃避有關
   接下來試圖研究TET1敲低是否轉錄抑制HCC細胞中的腫瘤抑制基因表達。RNA-seq結果顯示，TET1敲低下調了幾種參與腫瘤進展的腫瘤抑制基因，如WWC家族成員3（WWC3），腫瘤蛋白p53誘導核蛋白1（TP53INP1），UL16結合蛋白1（ULBP1）和賴氨酸脫甲基酶7A（JHDM1D）。為了研究circTRIM33-12是否通過miR-191 / TET1軸發揮其生物學功能，在circTRIM33-12和TET1敲低或過表達的HCC細胞中檢測WWC3 、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D的表達。敲低circTRIM33-12或TET1顯著減少了WWC3 、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D的表達。過表達circTRIM33-12或TET1增加WWC3 、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D mRNA和蛋白表達水平。使用熒光素酶報告基因測定驗證WWC3 、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D mRNA的3'UTR是否是miR-191的靶標。結果發現熒光素酶活性無明顯變化，這就說明WWC3 、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D mRNA的3'UTR不是miR-191的靶標。為了進一步探討circTRIM33-12與免疫逃避之間的關系，檢測200例HCC癌和癌旁組織中NKG2D的表達。在HCC組織中NKG2D陽性細胞的數目與癌旁組織相比較顯著降低。散點圖分析揭示了在HCC組織中circTRIM33-12表達和NKG2D陽性細胞數之間呈正相關性。這些結果表明，circTRIM33-12可通過海綿吸附作用miR-191保護TET1而發揮其抗腫瘤作用。

七、miR-191的敲低改變了circTRIM33-12的敲低并誘導了HCC細胞的進展
   接下來探討了miR-191的敲低是否影響了cirTRIM33-12敲低的HCC細胞增殖、遷移和侵襲。在敲低cirTRIM33-12的細胞系中，敲低miR-191 ，TET1蛋白表達升高，mRNA表達無變化。在敲低cirTRIM33-12的細胞系中，miR-191的敲低顯著降低了HCC細胞增殖、遷移和侵襲。

結論：
   在HCC組織中circTRIM33-12表達顯著降低，并且低水平的circTRIM33-12表達與HCC患者的不良預后相關。circTRIM33-12通過吸附miR-191并上調TET1表達抑制HCC增殖、轉移和免疫逃避，表明其在HCC進展中的腫瘤抑制作用。為HCC靶向治療提供了新的靶點。