N6-甲基腺苷(m6A)甲基化，一種具有新表觀遺傳功能的修飾，據報道參與肝細胞癌(HCC)的腫瘤發生，為該疾病的發病機制提供了新的見解。m6A甲基化的關鍵成分，腎母細胞瘤1相關蛋白(WTAP)在HCC尚未得到很好的研究。本實驗研究了WTAP在肝癌中的生物學作用和潛在機制。該研究發現WTAP在HCC中顯著上調，并促進肝癌的發展。在功能上，WTAP促進了HCC細胞的體外和體內增殖能力和腫瘤生長。該研究首次報道WTAP介導的m6A甲基化在HCC腫瘤發生中起著至關重要的作用，并強調WTAP是HCC治療的潛在治療靶點。（IF=10.679）

技術路線：

結果：
一、WTAP過度表達與HCC預后不良相關
   從基因表達綜合數據集(Roessler liver)和癌癥基因組圖譜(TCGA)數據分析WTAP在人類HCC樣本中的基因表達，結果顯示腫瘤組織中WTAP表達顯著增高(圖1a)。WTAP蛋白水平在HCC組織中也顯著上調(圖1b)，這進一步被東京都市區隊列的IHC染色證實(圖1c，d)。Kaplan-Meier分析顯示，WTAP表達水平較高的患者總體生存率和無病生存率較低(圖1e)。此外，WTAP的過度表達被發現是骨關節炎的獨立預后因素(p= 0.008)和DFS(p= 0.013)在HCC患者中(圖1f)。結論，WTAP在HCC受到上調，這與其預后不良密切相關。

                                      圖1. 上調的WTAP表達與HCC的不良結果有關。

二、WTAP促進體內外腫瘤增殖和致瘤能力

   WTAP的敲除和過表達分別在Huh7/Hep3B/PLC/PRF/5和SMMC-7721/HCCLM3細胞中進行。CCK-8和菌落形成試驗表明，WTAP缺乏抑制所有三種細胞系的增殖能力，當WTAP被過度表達時結果是相反的(圖2a-c)。EdU試驗檢測到細胞生長隨著WTAP敲除而降低(圖2d)。通過皮下注射HCC細胞構建腫瘤異種移植模型驗證WTAP在體內的作用，將穩定敲除(shWTAP #1、#3)或WTAP過度表達(WTAP-OE)的細胞植入裸鼠體內發現WTAP耗竭抑制腫瘤的發生(圖2e)，與陰性對照組相比腫瘤體積和重量顯著降低(圖2f，g)。WTAP的強制表達在異種移植小鼠中引起相反的表型(圖2h-j)。總之，WTAP在HCC發揮了腫瘤促進作用。

                                    圖2 . WTAP在體外和體內促進HCC細胞的腫瘤生長。

三、ETS1被確定為WTAP在HCC的潛在目標

   采用轉錄組測序來說明WTAP敲除細胞的轉錄變化來驗證WTAP在HCC發揮腫瘤促進作用的潛在機制。分層聚類顯示WTAP缺失后有1636個上調基因和794個下調基因(圖3a)。參考文獻以建立基因組重疊，Venn 圖共揭示了15個基因(圖3b)。RT-qPCR評估了WTAP對每個候選人的影響。其中，在WTAP沉默后，et1和et2持續顯著上調，當WTAP過度表達時，它們均適度下調(圖3c-e)。WB分析顯示，WTAP的失活顯著導致蛋白質水平上et1的升高，而不是et2的升高(圖3f，g)。該研究進一步證明了在Hep3B和HCCLM3細胞中ETS1的含量相反地受到WTAP的影響(圖3h, i)。因此推測ETS1的功能障礙可能是WTAP介導的HCC增殖信號的原因。

                                   圖3. 高通量測序組合顯示ETS1是WTAP的目標。

四、WTAP增加ETS1基因m6A修飾

   根據MeRIP-seq數據，ETS1的調制可能以m6A依賴的方式發生。采用m6A點印跡法和RNA甲基化定量法測定陰性對照組和穩定WTAP敲除組中m6A的整體水平，m6A水平隨著兩個HCC細胞系中WTAP的缺失而顯著降低(圖4a，b)。MeRIP-qPCR分析確定，與IgG對照相比m6A特異性抗體強烈富集ETS1轉錄物。此外，該研究發現WTAP沉默后m6A修飾的ETS1數量顯著減少(圖4c)。用一個野生型(WT)和兩個突變型(Mut)質粒進行熒光素酶報告分析，對于Mut報道預測m6A位點中的幾個腺苷堿基(A)被胞嘧啶堿基(C)取代，以消除m6A甲基化的影響，而WT報道包含完整的m6A位點(圖4d)。在WTAP敲除下，野生型組的熒光素酶活性適度增強，而野生型組的熒光素酶活性肯定對WTAP沉默的影響產生了抗性(圖4e)，說明ETS1的監管受WTAP指導的m6A修改控制。該研究進一步證實WTAP和ETS1的關聯可能不在蛋白質水平，而是在RNA水平。

五、WTAP以m6A-HuR介導的方式抑制ETS1的表達

   因為m6A修飾的轉錄物依賴效應蛋白在生物學過程中發揮功能，YTHDF2、m6A readers蛋白經常參與調節基因的降解。HuR的減少顯著減輕了ETS1的表達(圖4f)。與IgG對照相比，HuR特異性抗體顯著富集ETS1 mRNA，而抑制WTAP顯著增強ETS1 mRNA的富集，如RIP-qPCR所示(圖4g)。WTAP通過干擾HuR蛋白和ETS1基因的結合來抑制ETS1，而不是改變HuR的表達。此外，WTAP敲低引起的ETS1的升高可以通過HuR的衰減來恢復(圖4h)。。該研究發現敲除WTAP可以延長ETS1RNA的半衰期，而HuR沉默可以逆轉這種效應(圖4I)。熒光素酶報告分析確定了HuR參與m6A修飾，在WT組中WTAP沉默誘導的熒光素酶活性的增強可以被HuR挽救。當ETS1的m6A位點發生突變時，HuR表達的改變似乎對熒光素酶活性無效(圖4j)。總之，該研究的發現表明WTAP通過m6A-HuR依賴途徑抑制ETS1。

                                      圖4. WTAP以m6A-HuR介導的模式抑制ETS1。

六、ETS1作為腫瘤抑制因子，逆轉了WTAP在HCC的作用

   29對HCC標本中ETS1在HCC腫瘤及鄰近組織中的表達，與HCC的癌旁組織相比ETS1在腫瘤組織中的表達較低(圖5a，b)。此外，該研究發現基于共鄰體1的IHC染色，鄰近組織中的陽性率明顯更高(圖5c，d)。根據TCGA數據，高水平的ETS1意味著更好的預后5e)。體外功能驗證(包括CCK-8和菌落形成)表明，敲除ETS1可增強MHCC97H、HCCLM3和Huh7細胞的增殖能力(圖5f、g)。此外，ETS1沉默挽救了WTAP敲除對HCC細胞生長和生存能力的抑制作用(圖5h，I)。因此，ETS1的失活可能導致HCC通過WTAP-ETS1軸的進展。

                                  圖5. ETS1通過WTAP介導的表型逆轉在HCC發揮腫瘤抑制作用。

七、WTAP的沉默導致G2/M通過ETS1-p21/p27軸在HCC被捕

   WTAP敲低造成大量G2/M阻滯(圖6a,b)，而過度表達促進了G2/M期轉變。當WTAP在轉錄水平失活時，p21和p27(在細胞周期和增殖中起重要作用的腫瘤抑制因子)的表達顯著增加(圖6c,d)。WB驗證了WTAP敲除上調p21和p27，同時下調CDC25C、CDK1、細胞周期蛋白-A2和細胞周期蛋白-B1(圖6e)。相反，WTAP的過度表達減輕了p21和p27的表達，并降低了G2期所有指示的檢查點蛋白的放大倍數(圖6e)。由WTAP沉默引起的G2/M阻滯與ETS1的抑制顯著相反(圖6f，g)，ETS1的敲除導致p21和p27的減少，WB分析揭示了相同的結論(圖6h)。芯片分析表明ETS1可以結合它們的啟動子(圖6I)，說明ETS1可以增強p21和p27的轉錄。ETS1的抑制恢復了由WTAP抑制引起的p21和p27的高表達(圖6j)。這些數據表明，ETS1-p21/p27軸對于HCC依賴WTAP的細胞周期調節至關重要。

                                   圖6. WTAP通過減輕p21和p27的表達參與細胞周期。

八、高WTAP和低ETS1表達的組合預測了HCC的不利結果

   為了評估WTAP和ETS1之間的臨床相關性，在同一個來自cohort1的HCC標本中進行了WTAP和ETS1染色的IHC分析。WTAP表達較高的樣本中，近65.2%呈現較弱的ETS1染色，而WTAP表達較低的樣本中，約55.6%呈現較強的ETS1染色(圖7a，b)。高表達WTAP或低表達ETS1與HCC患者預后不良獨立相關(1e、f和5e)。然后Kaplan-Meier 在這兩個要素結合的基礎上進一步證明了HCC個人與WTAPhigh的表達ETS1low總體存活率比任何其他組都差(P= 0.0002)，特別是與那些在WTAP的人相比lowETS1high(圖7c)。圖解模型(圖7d)說明了該研究在WTAP介導的m6A調控方面的發現。在臨床樣本中，WTAP和ETS1呈負相關，WTAP和ETS1的共表達模式可能被認為是HCC的有效預后因素。

                                   圖7. 高WTAP表達與低ETS1表達相關，顯示HCC預后不良。

結論：

   該研究闡明了WTAP和激活的WTAP介導的m6A機制在人類HCC中的致癌作用。WTAP上調有助于ETS1的m6A修飾，然后通過HuR相關的方式表觀遺傳學沉默ETS1。該研究的發現豐富了m6A甲基化在腫瘤特征中的功能價值，并為探索治療HCC的有效治療策略開辟了潛在的途徑。