肝纖維化是肝臟受到各種理化因素損傷，肝細胞發生炎癥、壞死，并且在壞死區內細胞外基質過度沉積的一種疾病，可發展為肝功能失常的肝硬化，甚至肝癌，有效干預肝纖維化的發生，能預防肝硬化和肝癌的發生，因此，肝纖維化是目前肝病領域的研究熱點。肝星狀細胞（HSC）的活化被認為是肝纖維化形成的重要環節，其合成和分泌的細胞外基質在肝過度沉積可引起肝纖維化。今天小編就和大家分享一篇關于自噬和外泌體介導的HSC活化進而影響肝纖維化進程的文獻。

技術路線

1. TRIB3表達升高有助于肝纖維化的進展
      纖維化肝中TRIB3,LC3-II:LC3-I, BECN1, PIK3C3,可溶性和不可溶性SQSTM1是升高的，看到TRIB3-SQSTM1和 SQSTM1-LC3相互作用，TRIB3的表達和SQSTM1或者LC3的表達是正相關，肝細胞和HSC細胞增加，TRIB3與SQSTM1共定位增加。

2.TRIB3敲除保護小鼠免受TAA誘導的肝纖維化
      TAA處理12周后，Trib3敲低小鼠顯示較少的結節、黃疸和肝臟浸潤性炎癥細胞減少，肝臟的間質非血管區膠原積聚減少，羥脯氨酸含量降低，Col1a1，Timp1和Tgfb1的mRNA水平降低。TAA處理的Trib3 [LKD]小鼠中ACTA2表達減弱。為檢測沉默TRIB3是否可以通過自噬影響肝纖維化，檢查自噬信號蛋白在纖維化肝組織中的表達。沉默Trib3抑制LC3-II：LC3-I，BECN1和PIK3C3表達，也減少不溶性SQSTM1在TAA處理肝臟中的聚集，不影響可溶性SQSTM1的水平。這些數據表明TRIB3通過抑制自噬來介導肝纖維化。

3.TRIB3與SQSTM1相互作用以阻止肝細胞中晚期內體的自噬降解
      饑餓的原代小鼠肝細胞TRIB3和SQSTM1有關系，在肝細胞中共表達SQSTM1和 LC3，不管有沒有TRIB3，SQSTM1都能與LC3共沉淀，這個相互作用能被TRIB3的過表達減弱。原代肝細胞過表達TRIB3增強LC3-II：LC3-I，BECN1，PIK3C3和SQSTM1的表達和不溶性SQSTM1的聚集。
      為確認TRIB3在抑制自噬流中的作用，LC3的腺病毒感染肝細胞測定自噬流，基于溶酶體GFP猝滅的概念。饑餓細胞后檢測到RFP-GFP-LC3為紅色斑點，而TRIB3過表達增加黃色斑點的存在和動態移動，TRIB3表達升高增加自噬體、MVB的數量。量化多泡體MVB分布，測量核周溶血磷脂酸（LBPA），LBPA +區域被定義為位于核心2μm范圍內。與對照肝細胞相比，CQ處理細胞和TRIB3過表達細胞均表現出核周LBPA +片段增加和LBPA +斑點尺寸擴大。使用CD63和溶酶體標記LAMP1（溶酶體相關膜蛋白1）免疫染色精確界定CQ處理或TRIB3過表達的肝細胞細胞器的改變，CD63和LAMP1的共定位在肝細胞中增強，而CQ治療或TRIB3過表達顯著減少這種共定位。

4.TRIB3促進肝細胞的外泌體分泌
      鑒于自噬功能障礙是一個外泌體釋放的關鍵因素，推斷TRIB3介導的抑制自噬流的變化可導致肝細胞外泌體分泌增強。ESCRT（內體運輸所需的分選復合物） 對MVB的形成和MVB來源外泌體的分泌至關重要，TRIB3過表達肝細胞表現出TSG101（腫瘤易感性101 [ESCRT-I的亞基]）水平顯著增加。共感染Tsg101和Sqstm1的肝細胞，在TRIB3過表達的肝細胞中TSG101與SQSTM1共定位增加。沉默Trib3促進CHX處理的肝細胞中TSG101和SQSTM1的降解，自溶酶體抑制劑巴弗洛霉素A1也有可以降解這兩個分子。為確認TRIB3參與的外泌體釋放，從Trib3感染肝細胞的培養基中分離外泌體，并用動態光散射系統鑒定，檢測TRIB3過表達肝細胞上清液中外泌體的數量增加。TRIB3-過表達肝細胞外泌體標志物如TSG101，HSPA8 / HSC70，和GAPDH以及TRIB3和SQSTM1的表達增加，能被Tsg101缺失逆轉。

4.TRIB3通過肝細胞衍生的外泌體激活HSC（肝星狀細胞）
      用過表達TRIB3肝細胞的外泌體（HepaTRIB3-外泌體）處理HSCs，可看到HSC顯著激活，增殖和遷移。200個細胞因子抗體在HepaTRIB3-外泌體中鑒定潛在的HSC激活劑，發現有175種蛋白質沒有表達變化或低表達，16種蛋白質下調，9種蛋白質上調。從肝細胞中分離的外泌體處理HSC，大部分外泌體被HSC吞噬（圖5E）。INHBA是HepaTRIB3外泌體中最豐富的細胞因子，Inhba敲低肝細胞分泌的外泌體降低HSC中ACTA2和COL1A1的表達。

5. 融合肽Pep2-A2能打亂TRIB3和SQSTM1的相互作用并且回復自噬
      融合肽Pep2-A2處理抑制過表達TRIB3和SQSTM1的肝細胞中的相互作用和共定位和SQSTM1，用Pep2-A2預處理肝細胞恢復TRIB3抑制的自噬通量，減少培養基中外泌體的數量，消除HepaTRIB3-外泌體的HSC激活作用，HSC中的分化轉移信號蛋白MMP2和MMP9也減少。

6. 破壞TRIB3-SQSTM1相互作用會減少肝臟纖維化
      評估Pep2-A2在BDL-或TAA誘導小鼠肝纖維化模型中的作用。Pep2-A2治療小鼠顯著降低BDL誘導肝纖維化（肝臟形態和膠原沉積改善），肝臟促纖維化基因的表達和羥脯氨酸含量也降低，纖維化肝組織中TRIB3與SQSTM1共定位減少。Pep2-A2處理小鼠中自噬體和MVBs減少，膠原沉積和ACTA2表達減少，羥脯氨酸和Col1a1 mRNA表達減少。這些數據證實了破壞TRIB3-SQSTM1相互作用，通過恢復受阻的自噬通量，來發揮有效的肝纖維化治療效果。

總結：1. TRIB3表達與肝纖維化密切相關
         2. TRIB3與SQSTM1相互作用減弱自噬
        3. TRIB3促進肝細胞的外泌體分泌增多，進而可以激活HSC細胞
       4.破壞TRIB3-SQSTM1相互作用會減少肝臟纖維化
      肝纖維化的進程是一個非常復雜而漸進的過程，受到多種分子及細胞內多種信號轉導通路網絡的調控。盡管目前對肝纖維化的研究已取得初步的進展，其確切的機制及尋找其治療靶點仍需深入探討。